American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine Vol 167. pp. 1695-1703

Экспрессия воспалительного белка макрофагов MIP-3beta/CCL19 при легочном саркоидозе

Agata Gibejova, Frantisek Mrazek, Daniela Subrtova, Veronika Sekerova, Jaroslava Szotkowska, Vitezslav Kolek, Roland M. du Bois and Martin Petrek
Departments of Immunology and Respiratory Medicine, Palacky University, Olomouc, Czech Republic; and Interstitial Lung Disease Unit, Royal Brompton Hospital, London, United Kingdom

Реферат

В этом исследовании, экспрессия мРНК хемоаттрактантов лимфоцитов, лейкотактина-1, воспалительного белка макрофагов MIP-3alpha и MIP-3beta были исследованы у клеток бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) пациентов с саркоидозом, болезни с типичным CD4+ лимфоцитарным альвеолитом. Из этих трех хемокинов, только экспрессия мРНК MIP-3beta была увеличена при саркоидозе, поэтому были исследованы белковые уровни этого хемокина, его фармакологическое регулирование и связь с клиническим курсом болезни. Белковые уровни MIP-3beta были увеличены в БАЛ пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля (p = 0.001) и у пациентов с рентгенографической стадией II по сравнению с пациентами с рентгенографической стадией I (p = 0.003). MIP-3beta главным образом был локализован на альвеолярных макрофагах и коррелировал с числом лимфоцитов в БАЛ и субпопуляциями Т-клеток. Экспрессия мРНК для рецептора MIP-3beta CCR7 была увеличена и коррелировала с белковыми уровнями MIP-3beta. Экспрессия мРНК MIP-3beta в клетках БАЛ ингибировалась дексаметазоном и циклоспорином А in vitro. Таким образом, MIP-3beta вовлечен в привлечение Т-лимфоцитов при саркоидозе, связан с прогрессом болезни и регулируется препаратами, используемыми для лечения саркоидоза.

Введение

Саркоидоз - мультиорганная гранулематозная болезнь, наиболее часто воздействующая на легкие вследствие накопления CD4+ T-лимфоцитов и макрофагов (1). Механизм накопления воспалительных клеток в легком при саркоидозе не ясен. Однако известно, что провоспалительные цитокины и хемокины участвуют в этом процессе (2).

Хемокины - цитокины с низким молекулярным весом, традиционно разделяемые на четыре подгруппы (CC, CXC, CX3C и C), на основании структуры N-терминального мотива (3). Хемокины регулируют распределение лейкоцитов и играют существенную роль в воспалении (4). Недавно было описано несколько новых членов суперсемейства хемокинов (5), включая лейкотактин-1 (Lkn-1) (6), воспалительный белок макрофагов MIP-3alpha (7) и MIP-3beta (7, 8).

Хемокин MIP-3beta особенно сильно экспрессирован в лимфоидных тканях, принимая во внимание, что производство MIP-3alpha также было обнаружено в лейкоцитах периферической крови и некоторых эмбриональных тканях (7, 8). Экспрессия Lkn-1 наблюдается в печени, кишечнике и у лейкоцитов легкого (9). Ген, кодирующий хемокин MIP-3beta был картирован на хромосоме 9, принимая во внимание, что гены большинства других CC хемокинов (включая MIP-3alpha и Lkn-1) сгруппированы на хромосоме 17 (8). Хотя имеются существенные различия в тканевом распределении Lkn-1, MIP-3alpha и MIP-3beta, мРНК всех трех хемокинов была обнаружена ткани легкого человека (7, 9, 10).

Хемокин MIP-3beta - хемоаттрактант T- и B-лимфоцитов (11, 12), дендритных клеток (13), клеток предшественников макрофагов (14) и естественных киллеров (15). Поэтому, он может играть важную роль в тимусном траффике и миграции T- и B-клеток к вторичным лимфоидным органам (12, 16). Кроме того, недавно было показано, что MIP-3beta является медиатором быстрой адгезии нативных CD4+ T-лимфоцитов к активизированным эндотелиальным клеткам, поддерживая роль этого хемокина в регулировании миграции лимфоцитов (17). MIP-3beta действует посредством рецептора CCR7 (8). Хемокины Lkn-1 и MIP-3alpha - также являются хемоаттрактантами лимфоцитов, хотя по сравнению с MIP-3beta, их влияние на миграцию лимфоцитов является менее интенсивным. Lkn-1 привлекает моноциты, лимфоциты и эозинофилы посредством рецепторов CCR1 и CCR3 (6, 18). MIP-3alpha имеет промиграционный эффект на лимфоциты, нейтрофилы и незрелые дендритные клетки посредством рецептора CCR6 (13, 19).

Мы выдвинули гипотезу, что хемокины MIP-3beta, Lkn-1 и MIP-3alpha могут вносить вклад в развитие CD4+ лимфоцитарного альвеолита, который сопровождает легочный саркоидоз. Поэтому, мы исследовали экспрессию мРНК этих трех хемокинов у клеток бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) пациентов с саркоидозом по сравнению с групой контроля а также исследовали связь между экспрессией мРНК хемокинов и клеточным профилем БАЛ. Исследования экспрессии показали, что лимфоцитарный альвеолит связан с MIP-3beta. Поэтому, в дальнейшем мы сосредоточились на MIP-3beta. Белковые уровни MIP-3beta были измерены в БАЛ пациентов с саркоидозом и была оценена связь с клиническим курсом саркоидоза, согласно рентгенографической стадии и потребности в лечении. Кроме того, MIP-3beta в БАЛ был идентифицирован иммуноцитохимически и была определена экспрессия рецептора мРНК CCR 7 у клеток БАЛ. Наконец, чтобы исследовать, как текущие терапевтические подходы к саркоидозу влияют на MIP-3beta, мы изучили влияние дексаметазона и циклоспорина А на экспрессию мРНК MIP-3beta in vitro.

Группа исследования

Бронхоальвеолярный лаваж был выполнен согласно стандартной процедуре у 78 пациентов с саркоидозом и 11 индивидуумов группы контроля. Группа контроля состояла из индивидуумов, у которых во время проведения исследования и впоследствии не было клинических признаков воспаления легкого; они не имели никаких болезней легкого в медицинской истории. В группе контроля все имели нормальную цитологию, иммунологию и микробиологию БАЛ.

Диагноз легочного саркоидоза был основан на типичных клинических особенностях, обнаружении гранулем в материалах биопсии легкого, клеточном профиле БАЛ и базировался на критериях Statement on Sarcoidosis (21). Согласно оценке рентгенограммы легких, пациенты были разделены на стадии (стадия 0: n = 2, стадия I: n = 48, стадия II: n = 25, и стадия III: n = 3). Дополнительно, пациенты были разделены согласно курса болезни: пациенты, требующие лечения кортикостероидами (n = 40) и пациенты, которые не нуждались в лечениии (то есть, болезнь разрешилась спонтанно) (n = 38). Ни один пациент не получал лечение кортикостероидами до проведения бронхоальвеолярного лаважа. Схема лечения не отличалась от рекомендуемой в Statement on Sarcoidosis (21). Лечение стероидами проводилось согласно следующего протокола: (1) у всех пациентов с рентгенографической стадий III при постановке диагноза, (2) у пациентов с прогрессирующей и/или симптоматической стадией II болезни и (3) у пациентов с персистирующей стадией I или II. У пациентов с персистирующей болезнью лечение проводилось после по крайней мере 6 месяцев наблюдения. Исследование было одобрено комитетом по этике Palacky University, Olomouc.

Результаты

Экспрессия мРНК Lkn-1, MIP-3alpha и MIP-3beta у клеток БАЛ

Транскрипты мРНК Lkn-1 были найдены у 25 из 30 (83 %) пациентов с саркоидозом и у 11 из 11 (100 %) индивидуумов группы контроля. Экспрессия мРНК Lkn-1 была подобна в обеих группах (группа контроля 0.66 [0.38-0.93]; саркоидоз 0.62 [0.25-0.85]; p = 0.814).

Транскрипты мРНК MIP-3alpha наблюдались у 28 из 30 (93 %) пациентов с саркоидозом и у 10 из 11 (91 %) индивидуумов группы контроля. Экспрессия мРНК MIP-3alpha у клеток БАЛ пациентов с саркоидозом и в группе контроля была подобна (группа контроля 0.57 [0.26-0.95]; саркоидоз 0.62 [0.42-0.91]; p = 0.659).

мРНК MIP-3beta была обнаружена у 70 % (21 из 30) пациентов с саркоидозом, но только у 55 % (6 из 11) индивидуумов группы контроля. Важно, что экспрессия мРНК MIP-3beta была увеличена у пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля (группа контроля 0.00 [0.00-0.17]; саркоидоз, 0.33 [0.00-0.47]; p = 0.035).

Связь между экспрессией мРНК Lkn-1, MIP-3alpha и MIP-3beta и клетками БАЛ

Поскольку Lkn-1, MIP-3alpha, и MIP-3beta - новые хемоаттрактанты лимфоцитов, мы исследовали возможную связь между экспрессией мРНК и числом лимфоцитов в БАЛ. Экспрессия мРНК Lkn-1 и MIP-3alpha не коррелировала с числом лимфоцитов в БАЛ, ни с отношением CD4+/CD8+ ни с субпопуляциями лимфоцитов в БАЛ. Экспрессия мРНК MIP-3beta коррелировала с абсолютным (rs = 0.389, p = 0.017) и относительным (rs = 0.373, p = 0.019) числом лимфоцитов в БАЛ и кроме того CD4+ лимфоцитами (rs = 0.488, p = 0.003) но не с CD8+. Кроме того, имелась очень сильная связь между экспрессией мРНК MIP-3beta и отношением CD4+/CD8+ (rs = 0.541, p < 0.001). Связь между экспрессией мРНК Lkn-1, MIP-3alpha и MIP-3beta и числом макрофагов, нейтрофилов и эозинофилов в БАЛ также была исследована, но никакой связи найдено не было (p> 0.05).

Белковые уровни MIP-3beta в БАЛ и их связь с профилем клеток

Из-за обнаружения увеличения экспрессии мРНК MIP-3beta и ее связи с общим числом лимфоцитов в БАЛ, мы исследовали этот хемокин на белковом уровне. Белковые уровни в БАЛ были значительно увеличены у пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля (группа контроля 5.9 pg/ml [5.2-7.0]; саркоидоз, 11.2 pg/ml [6.9-47.6]; p = 0.001). Уровни MIP-3beta коррелировали с экспрессией мРНК MIP-3beta (rs = 0.320, p = 0.036). Белковые уровни MIP-3beta в БАЛ сильно коррелировали с абсолютным (rs = 0.500, p < 0.001) и относительным (rs = 0.53, p < 0.001) числом лимфоцитов в БАЛ. Имелась сильная корреляция между белковыми уровнями MIP-3beta в БАЛ и абсолютным числом CD4+ и CD8+ лимфоцитов в БАЛ (rs = 0.370, p = 0.002 и rs = 0.340, p = 0.005, соответственно). Связь между MIP-3beta и числом макрофагов, нейтрофилов и эозинофилов в БАЛ также были исследованы, но никакой связи обнаружено не было (p > 0.05).

Белковые уровни MIP-3beta и клинический курс саркоидоза

Чтобы оценить, связан ли MIP-3beta с курсом саркоидоза, его уровни были проанализированы в подгруппах пациентов с различными рентгенографическими стадиями и потребностью в лечении. Уровни MIP-3beta были значительно увеличены у пациентов с рентгенографической стадией II (n = 25) по сравнению с пациентами со стадией I (n = 48) (стадия I - 9.6 pg/ml [6.4-24.2]; стадия II - 48.6 pg/ml [9.3-213.0]; p = 0.003). Белковые уровни MIP-3beta в БАЛ были выше у пациентов, нуждавшихся в лечении (n = 40, 16.9 pg/ml [8.5-106.8]) чем у пациентов со спонтанной ремиссией (n = 38, 10.1 pg/ml [6.5-38.9]).

Определение клеточного источника MIP-3beta

Идентификация клеточного источника MIP-3beta была проведена у 17 пациентов с саркоидозом и 6 индивидуумов группы контроля. Белок был найден во всех исследованных образцах. Сильное, однородное окрашивание MIP-3beta наблюдалось у альвеолярных макрофагов. MIP-3beta также был связан с лимфоцитами; однако, окрашивание наблюдалось приблизительно у трети лимфоцитов БАЛ и было менее интенсивным, чем наблюдаемое у макрофагов.

Экспрессия мРНК CCR7 у клеток БАЛ и ее связь с профилем клеток БАЛ

Поскольку MIP-3beta - лиганд для CCR7, мы проанализировали экспрессию мРНК этого рецептора. мРНК CCR7 была обнаружена у 67 % (20 из 30) пациентов с саркоидозом и только у 36 % (4 из 11) индивидуумов группы контроля. Пациенты с саркоидозом имели более высокую экспрессию мРНК CCR7 (0.25 [0.00-0.51]) чем в группе контроля (0.00 [0.00-0.21]).

Экспрессия мРНК CCR7 коррелировала с абсолютным (rs = 0.356, p = 0.031) и относительным (rs = 0.338, p = 0.035) числом лимфоцитов БАЛ. Экспрессия мРНК CCR7 также была связана с CD4+ лимфоцитами (абсолютное число, rs = 0.469, p = 0.005; относительное число, rs = 0.380, p = 0.019) но не с CD8+ клетками. Кроме того, имелась связь между экспрессий мРНК CCR7 и отношением CD4+/CD8+ (rs = 0.435, p = 0.006). Связь между экспрессией мРНК CCR7 и числом других клеток БАЛ также была исследована: имелась связь между мРНК CCR7 и абсолютным (rs = 0.422, p = 0.009) и относительным (rs = 0.369, p = 0.021) числом нейтрофилов в БАЛ. Интересно, что экспрессия мРНК CCR7 коррелировала с белковыми уровнями MIP-3beta в БАЛ (rs = 0.314, p = 0.046).

Влияние дексаметазона и циклоспорина на экспрессию мРНК и белковые уровни MIP-3beta in vitro

Было исследовано влияние дексаметазона и циклоспорина экспрессию мРНК и белковые уровни MIP-3beta, чтобы выяснить влияние этих препаратов на экспрессию хемокина. Индуцированная фактором некроза опухоли альфа экспрессия MIP-3beta была значительно подавлена в клетках, культивируемых в присутствии дексаметазона и циклоспорина A. Экспрессия мРНК была уменьшена в 10 из 12 (83 %) образцах при культивировании с дексаметазоном и в 7 из 8 (88 %) образцах при культивировании с циклоспорином А (дексаметазон, p = 0.004; циклоспорин A, p = 0.009). Белковые уровни MIP-3beta уменьшились в 9 из 12 (75 %) образцах при культивировании с дексаметазоном и в 6 из 8 (75 %) образцах при культивировании с циклоспорином А (дексаметазон, p = 0.020; циклоспорин A, p = 0.029).

Обсуждение

Накопление иммунных клеток (макрофагов и CD4+ T-лимфоцитов) в легочном интерстиции и альвеолах - типичная особенность пациентов с легочным саркоидозом (1). Несколько хемокинов, таких как CCL5, MIP-1alpha (CCL3), MIP-1beta (CCL4), CCL2 и CXCL10, участвуют в привлечении лейкоцитов к легким пациентов (27-30). В этом исследовании, мы сосредоточились на недавно идентифицированных хемокинах Lkn-1, MIP-3alpha и MIP-3beta (5). Из этих трех хемокинов, экспрессия MIP-3beta была увеличена у клеток БАЛ пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля. Важно, что белковые уровни MIP-3beta в БАЛ были параллельны курсу болезни и были связаны со степенью лимфоцитарного альвеолита. Исследования рецептора MIP-3beta, CCR7, позволили обнаружить увеличение экспрессии мРНК CCR7 У клеток БАЛ пациентов с саркоидозом.

Результаты этого исследования согласуются с нашей первоначальной гипотезой, что новые хемокины, включая MIP-3beta, могут вносить вклад в привлечение лимфоцитов к легкому при саркоидозе. Во-первых, и белковые уровни и мРНК MIP-3beta были увеличены в БАЛ пациентов с саркоидозом. Во-вторых, имелась сильная корреляция между экспрессией MIP-3beta и общим количеством лимфоцитов в БАЛ а также с индексом CD4+ T-клеток в БАЛ. Кроме того, иммуноцитохимическое исследование показало, что фактически все альвеолярные макрофаги окрашивались для MIP-3beta, и только небольшая часть экспрессии MIP-3beta была связана с лимфоцитами БАЛ. Анализ показал более интенсивное окрашивание саркоидных макрофагов по сравнению с макрофагами группы контроля. В этом контексте, возможность, что существует другой источник производства хемокина, является маловероятной. Не более 1 % дендритных клеток экспрессируют этот хемокин в бронхоальвеолярных пространствах (31). Все эти факты предполагают, что альвеолярные макрофаги - действительно главный источник MIP-3beta в БАЛ, что согласуется с сообщениями об экспрессии MIP-3beta в других тканях (7, 33). Однако, категорический ответ относительно источника хемокина требует оценки транскриптов на уровне отдельной клетки. Наконец, мы обнаружили, что имеется связь между экспрессией MIP-3beta и его рецептором CCR7. Число транскриптов CCR7 коррелировало с экспрессией MIP-3beta, и у пациентов с саркоидозом была отмечена тенденция к увеличению экспрессии мРНК для молекулы CCR7, которая, однако, не специфична для MIP-3beta, поскольку может быть связана с другим лигандом CCL21 (34).

Наши результаты указывают, что произведенный макрофагами MIP-3beta вносит вклад в развитие альвеолита в легком при саркоидозе, привлекая CD4+ лимфоциты. Имеются данные, что MIP-3beta специфически привлекает CD4+ T-клетки (11). Однако, специфическая роль этого хемокина в процессе миграции клеток при саркоидозе может быть определена только в исследовании хемотаксиса клеток БАЛ.

В отличие от MIP-3beta, экспрессия мРНК других хемокинов Lkn-1 и MIP-3alpha, не отличалась между пациентами с саркоидозом и группой контроля и их экспрессия не была связана со степенью лимфоцитарного альвеолита. Эти хемокины скорее участвуют в регулировании физиологического траффика Т-клеток, чем являются медиаторами болезни (16, 35). Хотя мРНК этих двух хемокинов была экспрессирована у большинства участников исследования, экспрессия MIP-3beta была гетерогенной. Транскрипты MIP-3beta не были обнаружены не только у многих индивидуумов в группе контроля, но и приблизительно у трети пациентов с саркоидозом. Причиной этого не является погрешность метода: процедура проведения БАЛ и обработка материала были стандартизированы в наших предыдущих исследованиях (27, 29), как и процедура изоляции мРНК и ПЦР (22, 23). Наблюдаемая гетерогенность экспрессии MIP-3beta возможно может происходить из-за межиндивидуальных различий в иерархии экспрессии хемокинов.

Как было упомянуто ранее, сообщалось об увеличенной экспрессии хемокинов CC и CXC при саркоидозе (36) и о связи белковых уровней CCL2, MIP-1alpha (CCL3) и MIP-1beta (CCL4) с клиническим курсом болезни (28, 29, 37). В этом контексте интересно, что у наших пациентов с рентгенографической стадией II наблюдалась большая экспрессии MIP-3beta чем у пациентов рентгенографической стадией I. Также наблюдались различия в экспрессии MIP-3beta у пациентов с различной потребностью в лечении кортикостероидами (как меры прогресса болезни): белковые уровни MIP-3beta имели тенденцию быть выше у пациентов, нуждающихся в лечении, чем у пациентов со спонтанной ремиссией. Отсутствие существенных различий между активной и бездействующей болезнью могло наблюдаться вследствие того, что число пациентов в исследовании, возможно, было недостаточным, чтобы обнаружить различие в уровнях MIP-3beta. Схема лечения не отличалась от рекомендуемой в Statement on Sarcoidosis (21), поэтому маловероятно, что подобные результаты были получены вследствие использования врачами, участвующих в исследовании, различных критериев для начала лечения. Для более категорической интерпретации клинического значения увеличения экспрессии хемокинов при саркоидозе, необходимы дальнейшие исследования.

С практической точки зрения важно, что препараты, используемые для лечения саркоидоза, дексаметазон и циклоспорин A, подавляли in vitro экспрессию MIP-3beta у клеток БАЛ пациентов с саркоидозом. Наши данные in vivo также коррелируют с клиническими наблюдениями Hashimoto с коллегами (37): После успешного лечения кортикостероидами, увеличенные серологические уровни других хемокинов (CCL2 и MIP-1alpha), вернулись нормальным значениям. Потенциальная практическая важность сообщения об увеличении уровней MIP-3beta при саркоидозе, включая данные относительно его фармакологического регулирования, была бы усилена другими данными. Однако, мы не обнаружили сообщений, которые могли бы быть использованы для обсуждения потенциала MIP-3beta как терапевтической цели. Информации относительно экспрессии MIP-3beta и других хемокинов in vivo чень мало. По нашим данным, исследования экспрессии MIP-3beta при болезнях человека пока были ограничены синдромом Сьёгрена (38) и атеросклерозом (33). Сообщения об экспрессии MIP-3alpha более часты (40-42), но нет ни одного сообщения о его экспрессии при болезнях легкого.

Мы сообщаем, что экспрессия хемокина MIP-3beta и его рецептора CCR7 (но не хемокинов Lkn-1 и MIP-3alpha) - увеличена у клеток БАЛ пациентов с саркоидозом. Кроме того, мы продемонстрировали, что экспрессия мРНК MIP-3beta и белковые уровни CCR7 и мРНК коррелируют с числом лимфоцитов и что MIP-3beta локализован главным образом на альвеолярных макрофагах. Эти результаты указывают, что MIP-3beta участвует в сложном взаимодействии между лимфоцитами и цитокинами, которые определяют последующее развитие саркоидной гранулемы. Мы также показали, что экспрессия MIP-3beta может быть подавлена дексаметазоном и циклоспорином А, как на уровне мРНК, так и на белковом уровне. Эти данные и связь между MIP-3beta и клиническим курсом болезни говорят, что этот хемокин может быть важным медиатором патобиологических механизмов саркоидоза.