The Journal of Immunology, 2008, 181, 8784-8796

T-клеточный ответ на микобактериальную каталазу-пероксидазу. Профиль патогенного антигена при системном саркоидозе

Edward S. Chen, Jan Wahlstrom,, Zhimin Song, Matthew H. Willett, Maria Wiken, Rex C. Yung, Erin E. West, John F. McDyer, Ying Zhang, Anders Eklund, Johan Grunewald, and David R. Moller
Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Department of Medicine, Respiratory Medicine Unit, Department of Medicine at Karolinska University Hospital and Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden; and Department of Molecular Microbiology and Immunology, The Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, Baltimore, MD 21205

Реферат

Саркоидоз - системная гранулематозная болезнь, связанная с формированием эпителиоидных гранулем CD4+ T-клетками и Th1 цитокинами. Тканевые антигены, которые приводят к гранулематозному воспалению остаются неизвестными. В этом исследовании мы использовали тест IFN-gamma-ELISPOT и проточную цитометрию, чтобы оценить ответ T-клеток легких и периферической крови на предполагаемый патогенный антиген, каталазу-пероксидазу Mycobacterium tuberculosis (mKatG) у пациентов с саркоидозом из двух медицинских центров. Несмотря на фенотипические, генетические и прогностические различия пациентов, мы обнаружили, что T-клеточный ответ на mKatG был в высокой степени подобен в этих группах пациентов, с более высокой частотой mKatG-реактивных и экспрессирующих IFN-gamma T-клеток в периферической крови пациентов с саркоидозом по сравнению с индивидууами контрольной группы с положительной реакцией к туберкулину и с большим числом T-клеток, реактивных к туберкулину в одной из подгрупп пациентов. При саркоидозе, MKatG-реактивные CD4+ Th1 клетки предпочтительно накапливаются в легком, указывая на компартментализацию иммунного ответа. Пациенты с или без синдрома Лёфгрена имели подобную частоту mKatG-специфических экспрессирующих IFN-gamma T-клеток. Циркуляция MKatG-реактивных T-клеток была обнаружена при хроническом активном саркоидозе, но не у пациентов с бездействующей болезнью. Эти результаты демонстрируют, что ответ T-клеток на mKatG при саркоидозе соответствуют профилю, ожидаемому для патогенного саркоидного антигена и указывает на возможность иммунотерапевтического подхода к этой болезни.

Введение

Саркоидоз - системная болезнь, характеризованная формированием неказеозных эпителиоидноклеточных гранулем с поражением легких у более 90 % пациентов (1). Имеется значительная гетерогенность проявлений и клинического курса болезни. Например, пациенты с синдромом Лёфгрена имеют острое воспаление (узловатая эритема, двусторонняя внутригрудная лимфаденопатия, артрит голеностопных суставов) и имеют частоту ремиссии 70-80 % (2). Другие пациенты имеют рефрактерное, мультиорганное гранулематозное воспаление, которое может быть связано с прогрессирующим фиброзом и полиорганной недостаточностью. Заболеваемость саркоидозом и частота различных клинических проявлений изменяется в различных географических регионах среди различных и этнических и расовых групп (3). В Швеции ежегодная заболеваемость саркоидозом оценивается в 64/100,000, причем синдром Лёфгрена диагностируется примерно у 40 % пациентов (2). В США, ежегодная заболеваемость выше у чернокожих (35/100,000) по сравнению с белыми (11/100,000). Хронический или фатальный саркоидоз более обычен среди чернокожих американцев (3). В целом, всего 5-10 % пациентов с саркоидозом в США имеют синдром Лёфгрена (3, 4).

Несмотря на огромную клиническую гетерогенность, имеются иммунологические признаки, которые являются характерными для саркоидоза (5). Эти особенности включают присутствие мононуклеарного воспаления на участках формирования эпителиоидноклеточных гранулем, с преобладанием CD4+ T-клеток по отношению CD8+ (6). На участках воспаления имеется высоко поляризованный Th1 ответ с увеличенной экспрессией IFN- gamma, Th1 цитокинов (IL-12 и IL18) и Th1 хемокинов и рецепторов хемокинов (7, 8, 9, 10, 11). Цитокины TNF, IL6 и IL-1beta экспрессированы на участках формирования гранулем и участвуют в гранулематозном воспалении совместно с Th1 цитокинами (12). Исследования саркоидоза у человека показали свидетельства критически важной роли CD4+ T-клеток и поляризованного Th1 ответа а также связь саркоидоза с модификаторами Th1 ответа (например, IFN-gamma, IL-2, IFN-beta) и с сидромом иммунного восстановления у пациентов с ВИЧ, получающих интенсивную антиретровирусную терапию (13, 14). Хотя высоко поляризованный Th1 ответ является необходимой особенностью саркоидоза, тканевые антигены, ответственные за развитие местного Th1 ответа при саркоидозе остаются неизвестными (15).

Свидетельства, что гранулематозный ответ при саркоидозе происходит при участии тканевого антигена подтверждаются анализом экспрессии ТКР (16). Многочисленные исследования описали экспансию олигоклональных ТКР-ab+ T-клеток в при саркоидозе, что совместимо с управляемым антигеном иммунным процессом (17, 18, 19). Например, у HLA-DRB1*0301+ пациентов с саркоидозом из Швеции, наблюдается накопление CD4+ TCR-AV2S3+ T-клеток в легких (18). Несколько иследований сообщили, что олигоклональные популяции ТКР-ab+ T-клеток имеют подобия в CDR3 регионе a или b цепи, указывая на селекцию, вызванную определенным антигенным стимулом (20, 21). Попытки определить антигенную специфичность олигоклональных ТКР-специфических популяций Т-клеток при саркоидозе до настоящего времени были неудачными.

Ранее, используя протеомные технологии (4), мы идентифицировали специфический микобактериальный белок, каталазу-пероксидазу Mycobacterium tuberculosis (mKatG) в 55 % саркоидных тканей и этот белок был мишенью для циркулирующего IgG у 48 % пациентов с саркоидозом (22). Этот подход был основан на предположении, что патогенный ''саркоидный'' антиген является слабо растворимым компонентом саркоидной гранулемы и не нуждался в априорных гипотезах относительно его происхождения, т.е. может ли он быть получен из инородных или эндогенных белков. Идентификация mKatG как возможного ''саркоидного'' антигена последовала за многочисленными исследованиями, которые, используя ПЦР, сообщили о присутствии микобактериальной ДНК в 0-80 % саркоидных тканей (23). Несмотря на эти результаты, утверждение, что микобактериальные организмы этиологически связаны с саркоидозом остаются спорными из-за значительной вариабельности результатов в различных центрах и отсутствия доказательств участия специфического микобактериального антигена в развитии гранулематозного воспаления (24). Недавно сообщалось о T-клеточном ответе на некоторые микобактериальные белки, включая mKatG в периферической крови у пациентов с саркоидозом (25, 26, 27). Связаны ли эти микобактериальные белки с патогенезом саркоидоза, остался неясным, поскольку нет данных, что эти белки фактически присутствуют в саркоидных тканях и неизвестно, регулируется ли Т-клеточный ответ на эти белки аналогично ответу на предполагаемый патогенный агент саркоидоза.

В этом исследовании мы проверили гипотезу, что mKatG является специфическим антигеном при саркоидозе, оценивая T-клеточный ответ на этот антиген в двух группах пациентов с саркоидозом (из США и Швеции) которые имеют заметно различающиеся фенотипические, генетические и прогностические профили. Несмотря на эти различия, наше исследование показало, что T-клеточный ответ на mKatG в значительной степени подобен в обеих группах, причем циркуляция mKatG-реактивных, экспрессирующих IFN-gamma Т-клеток, у пациентов с саркоидозом была более значительной, чем у индивидуумов с отрицательной реакцией на туберкулин, с более высокой частотой, чем у T-клеток, реактивных к туберкулину, с предпочтительным накоплением mKatG-реактивных CD4+ T-клеток в легком и с персистирующим mKatG-специфическим T-клеточным ответом у пациентов с активной болезнью, но не у пациентов с бездействующей болезнью. Эти результаты демонстрируют, что T-клеточный ответ на mKatG регулируется аналогично ответу на предполагаемый патогенный агент саркоидоза. Это является основанием для рассмотрения антиген-специфических подходов для иммунотерапии этой болезни.

Пациенты

В исследование были привлечены пациенты с саркоидозом из специализированных клиник Johns Hopkins University в США и Karolinska Institute в Швеции. Диагноз саркоидоз был установлен согласно международного соглашения (1) при биопсии или клинически, когда начальные проявления были совместимы с синдромом Лёфгрена (узловатая эритема и/или острый артрит, внутригрудная лимфаденопатия) с исключением альтернативных диагнозов. Болезнь классифицировались как активная или ''бездействующая'' болезнь, на основании клинических проявлений, рентгенограмме грудной клетки, исследования функции легких, разрешения проявлений болезни или отсутствия прогресса болезни после окончания терапии в течение по крайней мере 1 года (28). Нелеченными считались пациенты, не получавшие системную терапию в течение 3 месяцев до начала исследования. В контрольную группу были включены здоровые индивидуумы с положительной кожной реакцией на туберкулин в течение предыдущего года или вакцинированные БЦЖ. Туберкулиновая кожная проба была выполнена в соответствии с установленными критериями, используемыми в соответствующих странах. В США, пациенты получали внутрикожную инъекцию 5 TU туберкулина (Tubersol, Aventis Pasteur); индурация >=10 мм через 48-72 ч рассматривалась как положительный результат теста (29). В Швеции, пациенты получили внутрикожную инъекцию 2 TU туберкулина; индурация > =6 мм через 72 ч рассматривалась как положительный результат теста. Все участники исследования дали письменное информированное согласие согласно протоколам, одобренным местными комитетами по этике.

Результаты

Циркуляция T-клеток, реактивных к mKatG у пациентов с саркоидозом из США и Швеции

Для определения профиля антиген-специфического T-клеточного ответа у пациентов с саркоидозом на предполагаемый антиген mKatG, с помощью ELISPOT была определена реактивность Т-клеток к рекомбинантному mKatG с использованием мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), изолированных у нелечнных пациентов с активным саркоидозом, здоровых добровольцев с отрицательной туберкулиновой кожной пробой или не привитых БЦЖ (PPD-/BCG- в дальнейшем PPD- пациенты) или у добровольцев с положительной туберкулиновой кожной пробой или привитых БЦЖ (PPD+/BCG + в дальнейшем PPD+ пациенты). Среди американских участников исследования мы обнаружили значительно более высокую частоту mKatG-реактивных T-клеток в PBMC у пациентов с саркоидозом по сравнению с PPD- пациентами (средняя частота: 14 sfc против 2 sfc на 10⁶ клеток, p = 0.026). Не имелось различий в частоте mMKatG-реактивных T-клеток у пациентов с саркоидозом по сравнению с PPD+ пациентами (14 sfc против 20 sfc на 10⁶ клеток, p = 0.899). Среди Шведских участников исследования, средняя частота mKatG-реактивных T-клеток у пациентов с саркоидозом была выше, чем у PPD- пациентов, но различие не было статистически значимым (28 против 10 sfc на 10⁶ клеток, p = 0.077). Как и в США, в Швеции не имелось различия между пациентами с саркоидозом и PPD+ пациентами (28 sfc против 33 sfc на 10⁶ клеток, p = 0.697). Попараный анализ показал, что в различных группах (PPD-, саркоидоз, PPD+) из одной страны различия не были статистически значимыми. Когда пациенты из обоих стран были объединены, различие между PPD- пациентами и пациентами с саркоидозом было статитстически значимым (p = 0.008) принимая во внимание, что не имелось различий между пациентами с саркоидозом и PPD+ пациентами (p = 0.545).

Учитывая различия демографических характеристик и клинических фенотипов между двумя странами, мы оценили операционные характеристики теста mKatG ELISPOT, определяя mKatG+ пациентов как пациентов со средней частотой реактивности к mKatG вдвое большей чем в контрольной группе и большей верхней границы у PPD- пациентов при 95% доверительном интервале в соответствующих странах (США > 13 sfc на 10⁶ PBMC; Швеция > 30 sfc на 10⁶ PBMC). Используя эти критерии мы обнаружили, что процент mKatG+ индивидуумов среди пациентов с саркоидозом США и Швеции был поразительно подобным (50 %, p = ns в обоих странах) и был значительно выше, чем процент среди PPD- пациентов в США или Швеции (p < 0.05 в обеих странах).

Реактивность T-клеток к mKatG не коррелирует с реактивностью Т-клеток к туберкулину при саркоидозе

Увеличенная частота реактивных к mKatG, экспрессирующих IFN-gamma T-клеток в крови пациентов саркоидоза предполагает предшествующее воздействие микобактериальных организмов. Чтобы исследовать, является ли mKatG доминирующим антигеном или сопровождается ответом на другие микобактериальные антигены, мы проанализировали ex vivo число PBMC, экспрессирующих IFN-gamma в ответ на туберкулин, для которых mKatG является минорным компонентом. Как и ожидалось, PPD+ пациенты характеризовались более высокой частотой PBMC, экспрессирующих IFN-gamma в ответ на туберкулин по сравнению с PPD- пациентамии из США (p = 0.002) и из Швеции (p = 0.019). В США, средний ответ Т-клеток на туберкулин был выше у PPD+ пациентов, чем у пациентов с саркоидозом (p = 0.004). Напротив, не имелось различий в реактивности Т-клеток на туберкулин между пациентами с саркоидозом и PPD+ пациентами из Швеции (p = 0.107). Пациенты с саркоидозом из Швеции характеризовались более высокой реактивностью Т-клеток к туберкулин, чем пациенты из США (p = 0.0005).

Когда был исследован объединенный ответ на mKatG и туберкулин, было обнаружено раздвоение реактивности Т-клеток на mKatG и туберкулин у пациентов с саркоидозом. В группе пациентов с саркоидозом с положительным результатом mKatG ELISPOT, 14 из 21 (67 %) пациентов имели более высокое число циркулирующих T-клеток, реактивных к mKatG чем к туберкулин предполагая что, mKatG является доминирующим микобактериальным антигеном в этой подгруппе пациентов. Остальные пациенты с саркоидозом в этой группе (7 из 21) имели более высокую реактивность Т-клеток к туберкулину, чем к mKatG, хотя они также имели положительный ответ на mKatG. В пределах группы пациентов с саркоидозом с отрицательным результатаом mKatG ELISPOT, 16 из 21 (76 %) пациентов имели более высокое число циркулирующих T-клеток, реактивных к туберкулину, чем к mKatG предполагая, что микобактериальные антигены, иные чем mKatG вызывают доминирующий Т-клеточный ответ в этой подгруппе пациентов. Это различие ответа на mKatG и туберкулин привели к отсутствию корреляции между ответом на туберкулин и mKatG в подгруппе mKatG+ пациентов, даже когда все пациенты с саркоидозом были сгруппированы вместе (коэффициент Спирмена rs = 0.190, p = 0.408). В целом, 34 из 42 (85 %) пациентов с саркоидозом имели T-клеточный ответ на mKatG или туберкулин, предполагая связь с микобактериальным воздействием у большинства пациентов с саркоидозом. PPD+ пациенты (13/13) характеризовались большей реактивностью Т-клеток к туберкулин чем к mKatG (p = 0.0002), предполагая, что mKatG является минорным антигеном для Th1 ответа у этих индивидуумов.

Компартментализация и усиление ответа на mKatG в легком пациентов с легочным саркоидозом

Чтобы определить, действительно ли локализация mKatG-реактивных T-клеток ограничена областями гранулематозного воспаления, мы исследовали клетки легкого и клетки ЖБАЛ у пациентов с саркоидозом, более 90 % из которых имеют поражение легкого. Мы обнаружили значительно увеличенное число клеток ЖБАЛ, экспрессирующих IFN-gamma в ответ на mKatG по сравнению с PBMC пациентов с саркоидозом из США (60 sfc против 14 sfc на10⁶ клеток, p = 0.002) и из Швеции (270 sfc против 28 sfc на 10⁶ клеток, p = 0.013). Средняя частота mKatG-реактивных T-клеток ЖБАЛ у Шведских пациентов была больше, чем у пациентов с саркоидозом из США, хотя различие не было статистически значимым (p = 0.151). Когда Американские и Шведские пациенты были объединены, различия между ответами клеток ЖБАЛ и PBMC на mKatG были статистически значимы (ЖБАЛ 70 sfc против PBMC 14 sfc на 10⁶ клеток, p < 0.0001). Дополнительный анализ клеток ЖБАЛ и PBMC у 16 пациентов подтвердил большую частоту mKatG-реактивных T-клеток в легком по сравнению с кровью (p = 0.0009), что совместимо с компартментализацией mKatG-реактивных T-клеток в легком при саркоидозе. В отличие от реактивности T-клеток ЖБАЛ к mKatG при саркоидозе, не имелось никаких свидетельств наличия большого числа экспрессирующих IFN-gamma mKatG-реактивных клеток БАЛ у трех пациентов без саркоидоза, у которых проводилась диагностическая бронхоскопия, которые имели 10 % лимфоцитов в ЖБАЛ (12 ± 6 sfc на 10⁶ клеток). Средняя частота реактивности T-клеток к туберкулину была выше у клеток ЖБАЛ по сравнению с PBMC среди пациентов с саркоидозом из обоих стран, с более высокой частотой клеток ЖБАЛ реактивных к туберкулину у пациентов с саркоидозом из Швеции по сравнению с США (255 sfc против 50 sfc на 10⁶ клеток, p = 0.009). Однако, в отличие от ответа на mKatG, ответ Т-клеток на туберкулин не имел существенных различий между легким и кровью (p = 0.168), предполагая, что T-клетки, реактивные к микобактериальному антигену, иному чем mKatG, имеют уменьшенный потенциал по способности локализоваться в легком.

CD4+ и CD8+ T-клетки в легком и крови экспрессируют IFN- gamma в ответ на mKatG

Для оценки относительного вклада CD4+ и CD8+ T-клеток в специфическом ответе на mKatG, PBMC и клетки ЖБАЛ пациентов с саркоидозом и контрольной группы (только в США) были окрашены для исследования внутриклеточной экспрессии IFN-gamma после инкубации с mKatG в течение 6 часов. PBMC PPD- пациентов демонстрировали низкий или невыявляемый ответ на mKatG у и у CD4+ и у CD8+ клеток. По сравнению PPD- пациентами, в крови пациентов с саркоидозом наблюдалось большое число mKatG-реактивных CD3+ T-клеток, из субпопуляций CD4 и CD8. Хотя средняя частота CD4+ и CD8+ mKatG-реактивных Т-клеток в крови пациентов с саркоидозом были подобны, имелся больший процент CD8+ чем CD4+ mKatG-реактивных, экспрессирующих IFN-gamma T-клеток (измеренный как процент от общего числа mKatG-реактивных CD3+ T-клеток крови) (p = 0.002), что объясняет относительную CD4+ лимфопению, типичную для пациентов с саркоидозом. В ЖБАЛ пациентов с саркоидозом были обнаружены и CD4+ и CD8+ T-клетки, реактивные к mKatG, причем у 40 % (4 из 10) пациентов более 0.5 % общего количества CD3+ T-клеток демонстрировали реактивность к этому антигену. Мы обнаружили большое число mKatG-реактивных CD4+ T-клеток в легком по сравнению с кровью (p = 0.05), что указывает на компартментализацию mKatG-реактивных Th1 клеток в легком. Подобная компартментализация не распространялась на CD8+ T-клетки, поскольку не имелось различий в числе CD8+ T-клеток, реактивных к mKatG в легком и крови (p = 0.655). Известно, что в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом наблюдается большее число CD4+, чем CD8+ T-клеток (1, 6).

Пролиферация антиген-специфических Т-клеток в легком и крови в ответ на mKatG преобладает у CD4+ T-клеток

Для оценки пролиферативного потенциала mKatG-реактивных T-клеток при саркоидозе, T-клетки PBMC и БАЛ были проанализированы с помощью проточной цитометрии. Для оценки уровня фоновой пролиферации в ответ на mKatG в контрольной группе были проанализированы восемь PPD- пациентов из США. Эти PPD- пациенты имели низкие или невыявленные уровни пролиферации CD3+ T-клеток в ответ на mKatG. При использовании верхней границы (0.72 %) как порога для определения пролиферативного ответа на mKatG, мы обнаружили, что 21 из 44 (48 %) пациентов с саркоидоза из США имели существенное усиление пролиферации CD3+ Т-клеток в крови в ответ на mKatG (среднее значение 0.615 %). Пролиферация в ответ на mKatG была самой интенсивной у субпопуляции CD3+CD4 + по сравнению с CD3+CD8+ T-клетками (0.895 % против 0.010 %, p < 0.0001).

Пролиферативный ответ у Т-клеток ЖБАЛ при саркоидозе значительно уменьшен по сравнению с пролиферативным ответом в крови, вероятно вследствие различия фенотипов клеток памяти для легочных T-клеток (39, 40). В этом контексте мы определили, стимулирует ли mKatG пролиферацию T-клеток ЖБАЛ у пациентов с активным легочным саркоидозом. У 5 из 14 (36 %) пациентов из США без саркоидоза мы обнаружили существенную пролиферацию CD3+ T-клеток ЖБАЛ в ответ на mKatG (>0.72 %). В отличие от T-клеток периферической крови, не имелось различий по проценту CD3+CD4 + Т-клеток ЖБАЛ, которые пролиферировали в ответ на mKatG, по сравнению с CD3+CD8+ T-клетками ЖБАЛ у пациентов с саркоидозом из США. С учетом более высокого числа CD4+ T-клеток по отношению к числу CD8+ Т-клеток ЖБАЛ, относительная частота CD3+ T-клеток ЖБАЛ, пролиферирующих в ответ на mKatG была больше в субпопуляции CD4+ (71 % от общего количества CD3+ клеток ЖБАЛ), чем в субпопуляции CD8+ (29 % от общего количества CD3+ клеток ЖБАЛ) (p = 0.0002). Доминирующий CD4+ ответ mKatG-реактивных пролифирирующих T-клеток был еще более значителен у PBMC (среденее значение 98 % от общего количества CD3+ клеток).

У Шведских пациентов, у которых была оценена только пролиферация CD4+ T-клеток, наблюдалась более интенсивная пролиферация CD4+ T-клеток в крови, чем в ЖБАЛ в ответ на mKatG (p = 0.052). Интересно, что при попарном сравнении PBMC-ЖБАЛ, наблюдалось расхождение числа mKatG-реактивных T-клеток в двух парах, у 4 из 12 пациентов наблюдалась пролиферация более 1 % CD4+ T-клеток только в одной из пар.

Более высокая частота mKatG-реактивных клеток в ЖБАЛ у DRB1*0301+ Шведских пациентов с саркоидозом коррелирует с числом AV2S3+ T-клеток в ЖБАЛ

В Швеции, DRB1*0301+ пациенты с саркоидозом характеризуются экспансией ТКР-специфических AV2S3+ T-клеток в легком и более высокой вероятность ремиссии чем у DRB1*0301- пациентов (41). Мы обнаружили, что DRB1*0301+ пациенты с саркоидозом из Швеции имеют более высокую частоту клеток ЖБАЛ, экспрессирующих IFN-gamma в ответ на mKatG, чем DRB1*0301- пациенты (315 sfc против 55 sfc на10⁶ PBMC, p = 0.041). Напротив, не имелось значительных различий между этими группами по числу mKatG-реактивных PBMC в крови (40 sfc против 27 sfc на10⁶ PBMC, p = 0.311). Ответ на mKatG был значительно выше у клеток ЖБАЛ, чем у PBMC у DRB1*0301+ пациентов, что совместимо с компартментализацией ответа на mKatG в легком этих пациентов. В отличие от mKatG, не имелось существенных различий по частоте T-клеток, реактивных к туберкулину в ЖБАЛ и PBMC у DRB1*0301+ по сравнению с DRB1*0301- пациентами. Мы обнаружили существенную корреляцию между числом AV2S3 + T-клеток ЖБАЛ и числом T-клеток в ЖБАЛ, реактивных к mKatG (rs = 0.448, p = 0.018) или туберкулину (rs = 0.413, p = 0.028).

Реактивность T-клеток к mKatG уменьшается при лечении или при неактивной, но не при хронической болезни

Чтобы проанализировать, коррелирует ли ответ на mKatG с проявлениями болезни, которые связаны с различной вероятностью ремиссии, мы сформировали две группы пациентов, с или без синдрома Лёфгрена при постановке диагноза (2). Мы не обнаружили существенных различий среднего ответа на mKatG в ЖБАЛ (p = 0.236) или крови (p = 0.378) между этими группами. Обе группы имели более высокую среднюю реактивность Т-клеток к mKatG в легком, чем в крови, хотя это различие не было статистически значимым в группе пациентов с синдромом Лёфгрена, которая имела меньший размер (p = 0.112).

Чтобы исследовать, влияет ли лечение, наличие неактивной или хронической болезни на частоту циркуляции mKatG-реактивных T-клеток, мы проанализировали PBMC пациентов с саркоидозом в пределах этих групп. Системная кортикостероидная или иммуносупрессивная терапия были связаны с уменьшением числа mKatG-реактивных, экспрессирующих IFN- gamma T-клеток по сравнению с нелеченными пациентами из США или при объединении Американских и Шведских пациентов (p = 0.031). Поразительно, что все пациенты с саркоидозом, у которых проявления клинически активной болезни отсутствовали в течение 1 года, характеризовались отсутствием циркуляции mKatG-реактивных T-клеток, предполагая, что пациенты с саркоидозом в ремиссии имеют очень мало mKatG-реактивных T-клетки в крови (p = 0.027). Поскольку у более 90 % пациентов с саркоидозом с ремиссией болезни она происходит в течение первых 3 лет после постановки диагноза (1), мы проанализировали ответ на mKatG у пациентов из США в зависимости от количества лет с момента постановки диагноза. Мы не нашли существенных различий по среднему ответу на mKatG в крови между пациентами с хроническим саркоидозом (болезнь диагностирована более 3 лет назад) и пациентами с хроническим саркоидозом с активной болезнью в течение менее 3 лет. Процент mKatG+ пациентов оставался постоянным (40-45 %) независимо от числа лет активной болезни, включая пациентов с активной болезнью в течение более 10 лет. Эти результаты совместимы с предположением, что в некоторых подгруппах пациентов с хроническим саркоидозом наблюдается продолжительный Т-клеточный ответ на mKatG.

Обсуждение

Патобиологические процессы, ведущие к системному гранулематозному воспалению при саркоидозе, изучены плохо. Иммунологические признаки саркоидоза, которые характеризуются накоплением CD4+ T-клеток, олигоклональностью ТКР-ab+ и производством Th1 цитокинов на участках воспаления, указывают, что развитие саркоидоза зависит от антиген-специфических Th1 клеток (1, 5). Используя протеомный подход, мы ранее идентифицировали микобактериальный белок mKatG, как патобиологически уместный кандидат в антигены для этой болезни (22). В этом исследовании мы получили прямые свидетельства, что T-клеточный ответ на mKatG при саркоидозе регулируются подобно ожидаемому для патогенного саркоидного антигена. Используя метод ELISPOT мы обнаружили поразительное подобие величины и распространенности T-клеточного ответа среди пациентов с саркоидозом с активной болезнью из США и Швеции, несмотря на значительную гетерогенность распространенности, клинических проявлений и ожидаемого исхода. Эти подобия дают основания считать, что mKatG-реактивные, экспрессирующие IFN-gamma эффекторные T-клетки играют роль в развитии саркоидоза в подгруппе пациентов с саркоидозом из США и северной Европы.

Наши результаты предполагают, что mKatG может быть уместным кандидатом в патогенные антигены в подгруппе пациентов с саркоидозом. Во-первых, эта подгруппа пациентов характеризовалась более высоким числом экспрессирующих IFN-gamma T-клеток, реактивных к mKatG по сравнению с туберкулином, предполагая, что mKatG является доминирующим антигеном при антимикробактериальном ответе у этих пациентов. Во-вторых, CD4+ Th1 клетки, реактивные к mKatG, накапливаются в легких пациентов с легочной болезнью, указывая на трафик этих антиген-специфических T-клеток к участку гранулематозного воспаления. Напротив, не имелось свидетельств селективного накопления PPD-реактивных, экспрессирующих IFN-gamma T-клеток в легких пациентов с саркоидозом, предполагая, что T-клетки, реактивные к микобактериальным антигенам, иным чем mKatG, имеют уменьшенный потенциал по локализации на участках саркоидного воспаления. Наконец, персистирование mKatG-реактивных, экспрессирующих IFN-gamma T-клеток у пациентов с хронической активной болезнью но не в пациентов в ремиссии или имевших бездействующую болезнь, поддерживает предположение, что mKatG-специфические, экспрессирующие IFN-gamma T-клетки являются важными эффекторами, которые участвуют в развитии хронического гранулематозного воспаления.

Обнаружение, что часть пациентов с саркоидозом имеет сильный ex vivo ответ на туберкулин, но низкое число mKatG-реактивных, экспрессирующих IFN-gamma T-клетки в крови говорит, что mKatG - не единственный возможный микобактериальный антиген при саркоидозе. Реактивные к туберкулину T-клетки в крови ранее были отмечены у пациентов с саркоидозом, с более слабым пролиферативным ответом чем в здоровой контрольной группе (39, 42). Недавно был зарегистрирован T-клеточный ответ на некоторые микобактериальные белки (ESAT-6, CFP-10, Ag-85, белок температурного шока -70) в некоторых группах пациентов с саркоидозом (25, 26, 27). Возможно, некоторые из этих антигенов также могли вносить вклад в репертуар PPD-реактивных, экспрессирующих IFN-gamma T-клеток в крови пациентов в нашем исследовании. Уместность этих микобактериальных белков в патогенезе саркоидоза остается сомнительной, поскольку они не были обнаружены в саркоидных тканях и при этом нет данных, что CD4+ T-клетки, реактивные к этим белкам селективно накапливаются на участках воспаления при саркоидозе или персистируют при хронической болезни.

То, что более 80 % пациентов с саркоидозом обладает существенным числом экспрессирующих IFN-gamma T-клеток, реактивных к mKatG или туберкулину указывает, что большинство пациентов с саркоидозом в нашем исследовании были чувствительными к микобактериальным антигенам до начала болезни. Поэтому, важно рассмотреть возможные различия в репертуаре T-клеточного ответа на специфические микобактериальные антигены, что может вносить вклад в различный исход болезни после воздействия микобактериальных организмов. Исследования ответа Т-клеток на специфические микобактериальные антигены у инфицированых M. tuberculosis индивидуумов, обычно включали белки, которые сильно экспрессированы (например, ESAT-6, CFP-10, Ag-85) и выявляют сильный T-клеточный ответ у большинства индивидуумов с активным туберкулезом (43). По нашим данным, T-клеточный ответ на mKatG не был оценен при активном туберкулезе. То, что в нашем исследовании у PPD+ пациентов наблюдалась циркуляция mKatG-реактивных T-клеток говорит, что T-клетки памяти к mKatG формируются после инфицирования M. tuberculosis или вакцинации БЦЖ. Однако, попарный анализ показал, что PPD+ пациенты имели большее число T-клеток, реактивных к туберкулину чем к mKatG, предполагая, что mKatG является минорным клеточным антигеном у этих индивидуумов. Факт, что группа пациентов с саркоидозом имела значительно большую реактивность Т-клеток к mKatG с небольшой или отсутствующей реактивностью к туберкулину указывают по крайней мере на одно различие иммунного ответа между саркоидозом и индивидуумами с латентной инфекцией M. tuberculosis или вакцинированных БЦЖ. Очевидно, что mKatG-реактивные, экспрессирующие IFN-gamma эффекторные T-клетки при саркоидозе могут вносить вклад в большую поляризацию Th1 ответа, отмеченную при саркоидозе по сравнению с туберкулезом (44).

Причины, по которой mKatG-реактивныме Т-клетки доминируют при саркоидозе, но не при латентной инфекции M. tuberculosis или при вакцинации БЦЖ, остаются неясными. Одним из поразительных различий между индивидуумами с латентной инфекцией M. tuberculosis и саркоидозом - отсутствие данных, что у пациентов с саркоидозом происходит реактивация живых микобактерий при бездействующей болезни, несмотря на годы кортикостероидной или иммуносупрессивной терапии. Это клиническое наблюдение ведет к гипотезе, что жизнеспособные микобактериальные организмы не присутствуют в саркоидных тканях и только некоторые остаточные микобактериальные белки, такие как mKatG, ведут к дифференциальному иммунному ответу (22). Также возможно, что между этими группами существуют различия по экспрессии mKatG в пораженной ткани, различия в процессинге mKatG дендритными клетками или макрофагами, зависящие от их активации или различия в присутствии кросс-реактивных (к другому микробному mKatG) или аутореактивных T-клеток, чувствительных к mKatG. Например, изоляты M. tuberculosis имеют значительную вариабельность в регионе mKatG, что может вносить вклад в различия экспрессии или в кодирования последовательностей, которые влияют на иммунный ответы (45). Наши результаты также совместимы с предположением, что активный саркоидоз может быть вызван нетуберкулезными микобактериальными организмами. В нашем первом исследовании, которое идентифицировало mKatG M. tuberculosis как кандидат в патогенные антигены, масс-спектрометрия и метод фингерпринтов показали наличие в одном образце ткани слабо растворимых антигенных пептидов, соответствующих mKatG M. smegmatis, что совместимо с предпосылкой, что нетуберкулезная mKatG может быть патогенным антигеном при саркоидозе (22). В этом исследовании, антитела к mKatG M. tuberculosis использовались для обнаружения mKatG в саркоидных тканях с помощью иммуноблоттинга. В этом исследовании мы обнаружили перекрестные реакции mKatG с нетуберкулезной микобактерией Mycobacterium smegmatis, но не с другими разновидностями (например, Mycobacterium chelonei). Таким образом мы не смогли определить точную разновидность микобактерии, из которой была получена mKatG (22).

Экспериментальные модели микобактериальной инфекции и аутоиммунных болезней указывают, что T-клетки, реактивные к микробным антигенам или патогенным тканевым аутоантигенам накапливаются на участках антигенного воздействия, где они могут производить воспалительный ответ (47, 48, 49). Наше исследование показало, что CD4+ экспрессирующие IFN-gamma Th1 клетки, реактивные к mKatG, накапливаются в легких пациентов с легочным саркоидозом, с меньшим количеством циркулирующих в крови mKatG-специфических CD4+ Th1 клеток. С помощью ELISPOT ранее было показано селективное накопление эффекторных T-клеток памяти при туберкулезе, малярии и других инфекциях (50, 51, 52, 53). Учитывая, что более 95 % T-клеток при саркоидозе имеет фенотип памяти CD45R0 +/CD45RA- (40, 54), наши результаты говорят, что в легком при саркоидозе наблюдается накопление mKatG-специфических эффекторных CD4+ Th1 клеток памяти. Пролиферация в ответ на mKatG также доминировала у субпопуляции CD4+ T-клеток, предполагая, что T-клетки памяти реактивные к mKatG с различной частотой присутствуют у пациентов с саркоидозом. Эта возможность перекликается с хронической бериллиевой болезнью, при которой у индивидуумов развивается гранулематозный пневмонит, гистологически идентичный легочному саркоидозу и наблюдается циркуляция бериллий-специфических CD4+ T-клеток с пролиферативной способностью, которые имеют фенотип T-клеток памяти (55).

Циркуляция mKatG-реактивных, экспрессирующих IFN-gamma T-клеток сохраняется при хронической болезни, но не наблюдается у пациентов, которые имеют бездействующую болезнь, предполагая, что эти T-клетки играют важную роль в продолжительном гранулематозном воспалении. Обнаружение, что в крови наблюдается большее количество CD8+ чем CD4+ mKatG-реактивных T-клеток, экспрессирующих IFN gamma и присутствие CD8+ mKatG-реактивных T-клеток в легком указывает, что существенный вклад в хроническое, управляемое IFN- gamma гранулематозное воспаление у этих пациентов могут вносить CD8+ mKatG-специфические T-клетки. При саркоидозе и туберкулезе, CD4+ T-клетки расположены спорадически по всей гранулеме, при этом CD8+ T-клетки преодладающе расположены на периферии гранулемы (1, 56, 57). В экспериментальных моделях микобактериальной инфекции была показана важность как CD4+, так и CD8+ T-клеток в защите хозяина против этих микроорганизмов и подобное взаимодействия между CD4+ и CD8+ mKatG-специфическими T-клетками могут быть уместны и при саркоидозе (58, 59, 60, 61).

Механизмы, которые участвуют в персистировании Th1 клеток на участках воспаления при саркоидозе в течение многих лет активной болезни остаются неясными. Одна из возможностей, обсужденная выше, заключается в том, что на участках гранулематозного воспаления происходит персистирование патогенного антигена, подбного mKatG, которых в нашем предшествующем исследовании был обнаружен в 50 % саркоидных тканей (22). Факт, что часть пациентов с саркоидозом имела более интенсивный ответ на mKatG чем на туберкулин, предполагает, что mKatG может быть преимущественно персистирующим антигеном, по сравнению с другими антигенами, содержащихся в туберкулине. При хронической бериллиевой болезни, CD4+ бериллий-специфические T-клетки в крови персистируют в течение многих лет болезни, даже через десятилетия после устранения профессионального воздействия бериллия (62). Поскольку структура гранулемы может препятствовать удалению слабо растворимого антигенного материала, возможно, что в пределах гранулемы mKatG существует в виде комплекса с другими белками, что приводит к очень медленному удалению этого антигена (63). Другая возможность заключается в том, что взаимная реактивность между микробными антигенами и аутоантигенами может играть роль при хроническом активном саркоидозе. Например, ответ на человеческий и микробный белок температурного шока обычно наблюдается у пациентов с саркоидозом и другими воспалительными болезнями (64). Альтернативно, mKatG-реактивные T-клетки могут персистировать из-за взаимной реактивности гомологичных пептидов окружающей среды с микобактериальными организмами. Поскольку показано, что гранулемы служат ''ловушкой'' для микобактериальных организмов, также возможно, что микобактериальные белки из окружающей среды могут пополнять ''запас'' микобактериального антигена на участках формирования гранулем (65). Еще одна возможность состоит в том, что mKatG-реактивные эффекторные T-клетки персистируют несмотря на постепенное удаление антигенной нагрузки в тканях. Несколько исследований показали, что эффекторные T-клетки памяти наблюдаются в течение продолжительного времени даже в отсутствие антигена (66, 67, 68).

Генетические факторы риска саркоидоза и существование различных клинических фенотипов вероятно связаны с MHC и аллелями HLA, хотя точные молекулярные механизмы, которые определяют исход саркоидоза остаются неизвестными (1, 69). Обнаружение, что DRB1*0301+ пациенты с саркоидозом имеют более высокую частоту mKatG-реактивных T-клеток по сравнению с DRB1*0301- пациентами, предполагает прямую связь MHC с Th1 ответом на mKatG. Поскольку DRB1*0301 был связан с синдромом Лёфгрена и хорошим прогнозом (41), возможно, что DRB1*0301+ может влиять на локальный Th1 ответ, связывая антигенные белки этого или других антигенов и влиять на клинический курс саркоидоза. На эту возможность указывает отсутствие различий в ответе на mKatG в крови у DRB1*0301+ по сравнению с DRB1*0301- пациентами, предполагая, что ответ на mKatG доминирует в ткани легкого, где имеется активное воспаление. Ранее сообщалось, что DRB1*03 связан с защитой от туберкулеза и благоприятным курсом болезни (70). Обнаружение, что частота mKatG-реактивных и PPD-реактивных экспрессирующих IFN-gamma Т-клеток в легком была выше у DRB1*0301+ пациентов, не противоречит предположению, что аллель DRB1*0301 может влиять на исход болезни, влияя на местный иммунный ответ на микобактериальные антигены. В будущих исследованиях необходимо определить, отражает ли связь DRB1*0301 и хорошего прогноза саркоидоза при синдроме Лёфгрена наличие подобных механизмов, которые могут вносить вклад в благоприятный исход при активном туберкулезе.

Мы обнаружили корреляцию между числом реактивных к mKatG и туберкулину клеток ЖБАЛ и числом AV2S3+ T-клеток ЖБАЛ у DRB1*0301+ Шведских пациентов, предполагая, что субпопуляция AV2S3+ T-клеток ЖБАЛ может содержать T-клетки, реактивные к mKatG или другим микобактериальным антигенам. Ранее было показано, что in vitro стимуляция периферических клеток крови вакцинированных БЦЖ DRB1*0301+ здоровых Шведских добровольцев экстрактом M. tuberculosis вызвает пролиферацию AV2S3+ T-клеток (71). В недавнем исследовании была описана новая методика, которая позволила идентифицировать 78 белков, которые выделены из молекул HLA-DR саркоидных клеток ЖБАЛ у DRB1*0301+ пациентов с саркоидозом, которые потенциально могли стимулировать AV2S3+ T-клетки (72). Эти эти белки включали аутоантигены, такие как лизил-тРНК синтаза и виментин. Некоторые из этих белков могут стимулировать экспрессию IFN-gamma T-клеток крови и ЖБАЛ пациентов с саркоидозом, но роль AV2S3+ T-клеток в таком ответе остается неясной (72). Можно предположить, что AV2S3+ T-клетки могут быть взаимно реактивными к некоторым аутоантигенам и mKatG или другим микобактериальным антигенам. Однако, мы не нашли очевидного соответствия нуклеотидных последовательностей между белками, связанными с HLA-DR и mKatG. Другая возможность заключается в том, что AV2S3+ T-клетки ЖБАЛ DRB1*0301+ Шведских пациентов с саркоидозом проявляют специфичность к mKatG или другому микобактериальному антигену и их экспансия происходит параллельно с аутореактивными T-клетками, экспрессирующими другие компоненты ТКР.

Факторы, определящие ремисиию или хронизацию саркоидоза остаются неизвестными. Идентификация этих факторов вероятно позволит разработать новые терапевтическин подходы к этой болезни. Мы обнаружили, что не имелось никакого различия между числом mKatG-реактивных, экспрессирующих IFN- gamma клеток в легком или крови у пациентов с или без синдрома Лёфгрена при постановке диагноза. Это подразумевает, что mKatG-реактивные Th1 клетки циркулируют при активном воспалении независимо от прогноза или последующего клинического курса саркоидоза. Это позволяет предположить, что mKatG является патогенным антигеном, универсальным триггером саркоидоза, но клинический исход болезни определяют другие факторы. Ранее был описан более слабо выраженный Th1 фенотип клеток ЖБАЛ у AV2S3+/DRB1*0301+ пациентов с саркоидозом, которые имеют благоприятный прогноз с ремиссией в более 80 % случаев (30). Другие исследования связали персистирующую экспрессию TNF клеток ЖБАЛ у пациентов с хронической болезнью (73). Будут ли mKatG-реактивные T-клетки иметь более слабо выраженный Th1 фенотип у пациентов с синдромом Лёфгрена или демонстрировать большую экспрессию TNF у пациентов с хроническим саркоидозом, должно быть определено в дальнейших исследованиях. Возможность, что некоторые mKatG реактивные CD4+ T-клетки экспрссируют IL-17 (т.е. являеются Th17 эффекторными клетками) указывает, что Th17 клетки могут иметь важную роль в защите хозяина против специфических патогенов (74, 75). В этом контексте, в будущих исследованиях необходимо выяснить, производят ли mKatG-специфические T-клетки TNF или IL-17 и существуют ли различия в профилях цитокинов производимых mKatG-реактивными эффекторными T-клетки в различных подгруппах пациентов. Также возможно, что mKatG-реактивные T-клетки с регулирующими свойствами (Tregs) могут влиять на исход болезни. Ранее было показано, что патоген-специфические Tregs могут регулировать иммунный ответ на микобактериальные антигены и регулируют имммунный ответ хозяина в экспериментальных моделях туберкулеза (76, 77, 78). Недавно было показано, что численность или функциональная способность клеток Tregs саркоидозе может быть нарушена, предполагая, что антиген-специфические Tregs могут вносить вклад в патогенез или влиять на исход саркоидоза (79, 80).

Наше исследование показало, что T-клеточный ответ на mKatG регулируются способом, который ожидается для предполагаемого саркоидного антигена. Присутствие, персистирование и преобладание mKatG-реактивных, экспрессирующих IFN-gamma T-клеток в подгруппе пациентов с саркоидозом вместе с обнаруженеим mKatG в саркоидных тканях является основанием для рассмотрения mKatG-специфического ответа как части иммунофенотипирующей схемы, которая может помочь при клинической оценке и предсказании курса болезни. Также возможно, что может быть разработана иммунотерапевтическая стратегия, которая может быть полезна для некоторых пациентов с саркоидозом.