Eur Respir J 2002; 20:1220-1227

Матриксные металлопротеиназы и тканевый ингибитор металлопротеиназы -1 при саркоидозе и IPF

M.T. Henry, K. McMahon, A.J. Mackarel, K. Prikk, T. Sorsa, P. Maisi, R. Sepper, M.X. FitzGerald and C.M. O'Connor
Dept of Medicine and Therapeutics, University College Dublin, Ireland. Faculty of Medicine and Biomedicine and Dept of Clinical Veterinary Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, University of Helsinki, Finland. Institute of Experimental and Clinical Medicine, Tallinn, Estonia

Реферат

Цель исследования состояла в том, чтобы исследовать роль интерстициальных коллагеназ, членов семейства матриксных металлопротеиназ (MMP) в развитии легочного фиброза. Активность, уровни и молекулярные формы коллагеназ (MMP-1, -8 и -13), желатиназы B (MMP-9) и их основного эндогенного ингибитора, тканевого ингибитора металлопротеиназы -1 (TIMP-1) были оценены в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) пациентов с идиопатическим легочным фиброзом (IPF) и у пациентов с саркоидозом с различной степенью вовлечения легочной паренхимы. Активность коллагеназы была увеличена при IPF и группе 3 пациентов с саркоидозом. Также наблюдалась положительная корреляция между активностью коллагеназы и уровнями MMP-8 в БАЛ. Вестерн-блоттинг показал присутствие двух изоформ MMP-8; 80 kD формы, представляющую латентный фермент полиморфоядерных нейтрофилов и 55 kD формы, представляющую проформу фибробластов. Уровни MMP-9 были увеличены при IPF и при саркоидозе, в то время как уровни TIMP-1 остались нормальными, указывая на изменение баланса между ферментом и его ингибитором. Матриксная металлопротеиназа -8 вносит основной вклад в активность коллагеназы в БАЛ у пациентов с идиопатическим легочным фиброзом и саркоидозом и может инициировать деструкции коллагена, ведущее к развитию легочного фиброза.

Введение

Идиопатический легочный фиброз (IPF) и терминальная стадия хронического саркоидоза характеризуются накоплением внеклеточного матрикса в альвеолярных стенках и воздушных пространствах, что отражает изменения гомеостаза синтеза и деградации коллагена (1, 2). Было обнаружено, что MMPs участвуют в процессе ремоделирования ткани и развитии фиброза, связанных с различными воспалительными состояниями (3-5).

Фибриллярный интерстициальный коллаген типа I и III составляет более 90 % коллагена в паренхиме легкого (6). MMP-1, -8 и -13 могут катализировать начальный этап их деградации. Таким образом, изменение уровней или активности MMPs может играть существенную роль в изменении метаболизма коллагена. MMP-1 (коллагеназа-1) деградирует преимущественно коллаген типа III. Она производится фибробластами, эндотелиальными и эпителиальными клетками и макрофагами (2, 3). MMP-8 (коллагеназа -2 или нейтрофильная коллагеназа), производится нейтрофилами и в меньшей степени хондроцитами, синовиальными фибробластами, эндотелиальными, эпителиальными и плазматическими клетками (7-10). MMP-8 преимущественно деградирует коллаген типа I. MMP-13 (коллагеназа-3), преимущественно деградирует коллаген типа II, но также эффективно деградирует коллаген типа I и III (11). Экспрессия MMP-13 наблюдается у разнообразных клеток, включая макрофаги, T-лимфоциты и плазматические клетки (10, 12, 13).

Увеличенная активность коллагеназы наблюдется в БАЛ пациентов с IPF и саркоидозом (14, 15). Увеличенная экспрессия MMP-1 у эпителиальных клеток наблюдалась в легком при IPF (16), предполагая, что коллагеназа -1 может вносить вклад в активность коллагеназы, наблюдаемую в БАЛ. Поскольку все три коллагеназы имеют различную активность и профиль ингибирования, необходимо определить, какой из ферментов (или комбинация ферментов) вносит вклад в коллагенолитическую активность при фиброзе. До настоящего времени, ни одно исследование не оценило связь между активностью коллагеназы и присутствием этих трех коллагеназ.

Недавнее исследование изучило роль желатиназы-B (MMP-9) и тканевого ингибитора металлопротеиназы-1 (TIMP-1) в ремоделировании дыхательных путей при хронической астме (17). Исследование показало, что дисбаланс производства MMP-9 и TIMP-1 может быть связан с развитием фиброза подслизистой основы у этих пациентов. Сообщалось об увеличенном производстве MMP-9 альвеолярными макрофагами при IPF и саркоидозе (18, 19). Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы оценить: 1) вклад трех коллагенолитических MMPs в уровни коллагеназ; и 2) относительные концентрации MMP-9/TIMP-1 в БАЛ пациентов с IPF и саркоидозом с различной степенью легочного вовлечения.

Пациенты

Группа пациентов с IPF состояла из 15 нелеченных пациентов со средним возрастом 66.5 лет. Диагноз был установлен в соответствии с недавно принятыми критериями (20). Диагноз был поддержан результатами биопсии в 6 случаях и компьютерной томографией с высоким разрешением (КТВР) во всех случаях.

Группа пациентов с саркоидозом включала 44 нелеченных пациента с легочным саркоидозом, диагностированном на основании характерных клинических и гистологических особенностей и/или характерных результатов КТВР, лимфоцитоза в БАЛ с увеличенным отношением CD4/CD8. Эта группа была разделена на 3 подгуппы, согласно прогноза (21). Группа 1 состояла из 16 пациентов с внутригрудной / средостенной лимфаденопатией, без легочных инфильтратов на КТВР. Группа 2 включала 14 пациентов с лимфаденопатией и легочными инфильтратами, но без признаков фиброза. Группа 3 включала 14 пациентов с легочными инфильтратами или фиброзом (n=5) без лимфаденопатии. У всех пациентов было проведено исследование функции легкого.

15 индивидуумов с нормальной функцией легкого и средним возрастом 45.6 лет были включены в группу контроля. Исследование было одобрено комитетом по этике.

Результаты

Клетки БАЛ

Общее количество и процент нейтрофилов были значительно выше при IPF по сравнению с группой контроля. При саркоидозе характерное увеличение числа лимфоцитов в БАЛ наблюдалось во всех группах. Число макрофагов в обоих группах значительно не различалось от группы контроля, хотя из-за увеличения процента нейтрофилов и лимфоцитов, наблюдалось относительное уменьшение процента макрофагов. Уровни белка в БАЛ пациентов с IPF не отличались от группы контроля, в то время как увеличенные уровни белка наблюдались во всех трех подгруппах пациентов с саркоидозом. Чтобы гарантировать, что различия уровней MMP и TIMP-1 не являются следствием увеличения уровня белка, все данные были пересчитаны на mL и µg белка.

Активность коллагеназы и уровни MMP-1, -8 и -13 в БАЛ

Активность коллагеназы в БАЛ была оценена по активации латентного профермента APMA, который не был выявлен в группе контроля, но был обнаружен у большинства пациентов с IPF (66 %, n=10) и саркоидозом (72 %, n=32). Значительно увеличенная активность коллагеназы наблюдались в группе IPF и в группе 3 пациентов с саркоидозом.

Аналогично, иммунореактивность MMP-8 не была выявлена в группе контроля, в то время как увеличенные уровни наблюдались у 73 % (n=11) в группе IPF и у 70 % (n=31) в группе 3 пациентов с саркоидозом.

MMP-1 был обнаружен только у одного индивидуума в группе контроля, у 53 % пациентов с IPF и 57 % пациентов с саркоидозом. Однако, в целом, уровни этой коллагеназы были ниже, чем MMP-8 и были значительно увеличены в группе 3 пациентов с саркоидозом.

Вестерн-блоттинг для MMP-13 показал присутствие 90 kD формы во всех образцах, с относительно низкими уровнями латентной 60 kD формы, активного 48 kD фермента и низкомолекулярного фрагмента MMP-13. Денситометрия показала, что уровни MMP-13 у пациентов значительно не отличались от группы контроля.

В образцах, где была обнаружена активность коллагеназы, наблюдалась сильная положительная корреляция между активностью и уровнями MMP-8 (r =0.68, p < 0.0001). Корреляция не зависела от наличия относительно небольшого числа образцов с очень высокими уровнями MMP-8 (> 20 ng·mL-1), поскольку она сохранялась, когда эти образцы исключались из анализа (r=0.53, p < 0.001). Не было обнаружено связи между активностью коллагеназы и MMP-1. Существенная, хотя и слабая корреляция наблюдались между числом нейтрофилов и активностью коллагеназы (r=0.263, p < 0.05) и уровнями MMP-8 (r=0.276, p < 0.05).

Молекулярные формы MMP-8 в БАЛ

Вестерн-блоттинг показал присутствие двух иммунореактивных форм, приблизительно 80 kD и 55 kD, представляющие изоформы нейтрофилов и фибробластов, соответственно. Также были обнаружены высокомолекулярные формы (> 100 kD), представляющие комплекс MMP-8 с TIMPs и MMP-8 димерами.

MMP-9 и TIMP-1

92 kD проформа MMP-9 была обнаружена в одном образце группы контроля, у всех 15 пациентов с IPF и у 35 (79 %) пациентов с саркоидозом. Как и в случае MMP-8 и -13, у небольшого числа пациентов наблюдались только следовые количества активизированной MMP-9 формы. Денситометрический анализ латентной 92 kD формы показал значительно увеличенные уровни proMMP-9 в у пациентов с IPF и в группе 3 пациентов с саркоидозом.

Хотя средние уровни proMMP-9 были выше у пациентов с IPF и в группе 3 пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля, это увеличение не было статистически значимым.

TIMP-1 был обнаружен в существенных количествах в группе контроля. Существенное уменьшение TIMP-1 наблюдалось в группе 1 и группе 2 пациентов с саркоидозом. Уровни в группе IPF и группе 3 пациентов с саркоидозом были подобны уровням в группе контроля. Сравнение молярного отношения уровней proMMP-9 с TIMP-1, демонстрировало увеличение уровней proMMP-9 у всех пациентов, хотя статистически значимое увеличение наблюдалось только группе 3 пациентов с саркоидозом.

Обсуждение

Дисрегуляция ремоделирования легочного матрикса, которая является следствием неспособности восстанавления повреждений, вызванных хроническим воспалением, возможно лежит в основе развития легочного фиброза. Чрезмерная деградация может быть триггером нерегулируемого производство компонентов матрикса, что характеризует развитие фиброза (4). Самым важным в патологии фиброза легкого является ремоделирование интерстициального коллагена. Из 16 членов семейства MMP, только три интерстициальных коллагеназы (MMP-1, -8 и -13), могут катализировать в норме ограниченный начальный этап деградации интерстициального коллагена. Необходимо определить, какая из коллагеназ или какая комбинация из трех MMPs вносит вклад в деградацию коллагена при фиброзе, чтобы исследовать их потенциальную индивидуальную или коллективную роль в этом процессе (5).

Наши результаты демонстрируют, что в БАЛ пациентов с IPF и саркоидозом в основном была обнаружена MMP-8. Значительно увеличенные уровни MMP-8 наблюдались при IPF и в группе 3 пациентов с саркоидозом, у которых также наблюдалась увеличенная активность коллагеназы в БАЛ и имелась прямая корреляция между уровнями MMP-8 и активностью коллагеназы. Подобные ассоциации не были обнаружены между активностью коллагеназы и MMP-1 или -13.

Обнаружение MMP-8 при IPF и саркоидозе является интересным в свете результатов недавнего исследования, которое показало, что перепроизводство MMP-8 связано с патогенезом незаживающих хронических язв (26). В этом контексте, присутствие значительно более высоких уровней MMP-8 в группе 3 пациентов с саркоидозом, которые имеют более серьезное функциональное ухудшение и худший прогноз чем группа 1 и группа 2, предполагает, что увеличенные уровни MMP-8 в БАЛ могут отражать подобный ''незаживающий'' ответ, подобный замеченному при хронической язве. Это совместимо с предыдущими наблюдениями авторов, что присутствие активности коллагеназы в БАЛ пациентов с саркоидозом в начале болезни было связано с последующим развитием хронической болезни (27).

Экспрессия MMP-8 наблюдалась у полиморфоядерных лейкоцитов (PMNs), синовиальных фибробластов, эндотелиальных клеток, эпителиальных клеток и плазматических клеток, и экспрессия MMP-8 у этих клеток может быть увеличена провоспалительными цитокинами, включая интерлейкин-1 и фактор некроза опухоли альфа (7-10). MMP-8, производимый не PMN клетками, отличается от PMN фермента по степени гликозилирования, и эти две изоформы MMP-8 можно различть по их молекулярному весу (7, 8). Латентный MMP-8, произведенный PMNs - высоко гликозилированный с молекулярным весом 80 kD, в то время как произведенный не PMN клетками имеет молекулярный вес 55 kD. Обе формы наблюдались в БАЛ пациентов с IPF и саркоидозом, указывая, что наблюдаемое увеличение уровней MMP-8 отражает увеличенное производство активизированными нейтрофилами и не PMN клетками. Это также отражается слабой ассоциаций между уровнями MMP-8 и числом нейтрофилов. Если бы нейтрофилы были бы единственным источником MMP-8, наблюдалась бы более сильная корреляция. Эти результаты поддерживают данные недавних гистологических исследований, которые продемонстрировали существенную экспрессию MMP-8 эпителиальными клетками и макрофагами в ткани легкого у пациентов с бронхоэктазами (9), в фиброзной ткани легкого (28) и в ткани легкого пациентов с хронической обструктивной болезнью легкого (29).

Вестерн-блоттинг также продемонстрировал присутствие высокомолекулярной (> 100 kD) формы, которая является комплексом MMP-8 с его ингибиторами (TIMPs) (7, 8). Также наблюдались высокомолекулярные формы MMP-13 и MMP-9. Присутствие MMPs, связанных с TIMP, наиболее вероятно отражает активацию фермента, сопровождаемую ингибированием in vivo. Ингибирование активизированных MMPs также отражается отсутствием активизированных форм в БАЛ. Учитывая высокие уровни TIMPs в БАЛ, неудивительно, что мы обнаружили очень мало активизированного фермента. Действительно, мы обнаружили, что для обнаружения активности коллагеназы в БАЛ требуется активация APMA (неопубликованные наблюдения), подтверждая, что активизированный фермент эффективно ингибируется in vivo.

Так как БАЛ содержит воспалительные компоненты, вероятно, измененное производство других коллагеназ также может вносить вклад в инициирование ремоделирования коллагена. Emonard с коллегами (30) обнаружили, что матрикс саркоидных гранулем индуцирует увеличенное производство MMP-1 фибробластами. Fukada с коллегами (16) продемонстрировали увеличение уровней MMP-1 в областях интраальвеолярного фиброза у пациентов с IPF. Однако, поскольку общепринято, что воспалительный компонент интерстициальных болезней легкого является триггером фиброзного ответа (1), вероятно производство существенных количеств MMP-8 нейтрофилами и стимулированными макрофагами, эпителиальными и/или эндотелиальными клетками, может нарушать гомеостаз между синтезом коллагена и его деградацией, вызывая процесс ремоделирования. Действительно, подобие уровней MMP-8 и уровней коллагеназ у пациентов с саркоидозом с и без фиброза, позволяет предположить, что производство MMP-8 может предшествовать фиброзу, так как клиническое данные указывают, что у пациентов в этой группе, у которых еще не развился фиброз, он вероятно разовьется позже (31). В этом контексте является интересным, что MMP-8 и нейтрофилы связаны с фиброзом легкого у пациентов с хроническим аллергическим пневмонитом, который подобен саркоидозу и обычно связан с лимфоцитарным альвеолитом (28).

Когда интерстициальные коллагеназы производят деградацию коллагена, коллаген становится восприимчивым к дальнейшей деградации другими MMPs, особенно желатиназами MMP-2 и MMP-9, которые вовлечены в развитие интраальвеолярного фиброза при IPF (18). В нашем исследовании, анализ показал, что главной формой желатиназы в БАЛ у пациентов с IPF и с саркоидозом была 92 kD proMMP-9. Уровни естественного ингибитора MMP-9, TIMP-1, не были увеличены по сравнению с группой контроля в любой из групп, предлагая тонкое изменение баланса между ферментом и его ингибитором в пользу MMP-9. Недавнее исследование также сообщает о увеличении уровней MMP-9 относительно уровней TIMP-1 в БАЛ пациентов с криптогенной пневмонией (32). Подобный дисбаланс производства MMP-9 и TIMP-1 был вовлечен в развитие фиброза подслизистой основы дыхательных путей при астме (17).

Интересно, что уменьшение уровней TIMP-1 наблюдалось в БАЛ группы 1 и 2 пациентов с саркоидозом, по сравнению с группой контроля, группой 3 пациентов с саркоидозом и пациентами с IPF. Хотя в настоящее время эти данные трудно интерпретировать, физиологическое значение этого наблюдения состоит в том, что группа 1 пациентов с саркоидозом более вероятно будет иметь спонтанное разрешение воспаления, чем прогрессировать к фиброзу. Вклад TIMP-1 в этот процесс требует дальнейшего исследования.

Наше исследование демонстрирует, что матриксная металлопротеиназа-8 - главная интерстициальная разновидность коллагеназы в дыхательных путях пациентов с идиопатическим легочным фиброзом и саркоидозом и ее производство полиморфоядерными лейкоцитами и неполиморфоядерными лейкоцитами увеличено. Исследование также демонстрирует, что увеличенное производство матриксной металлопротеиназы-8 и -9 не сопровождается компенсационным увеличением их эндогенного ингибитора, тканевого ингибитора металлопротеиназы-1. Поскольку объединенная активность этих двух ферментов может деградировать фибриллярные и базальные мембранные коллагены интерстиция легкого, их увеличенная активность может вносить вклад в разрушение матрикса и развитие фиброза. Анализ матриксной металлопротеиназы -8 и -9 в БАЛ может обеспечить полезные биохимические маркеры, чтобы контролировать курс и ответ на лечение идиопатического легочного фиброза и легочного саркоидоза.