Journal of Clinical Microbiology, January 2002, p. 198-204, Vol. 40, No. 1

Количественный анализ микобактериальной и пропионибактериальной ДНК в лимфатических узлах Японских и Европейских пациентов с саркоидозом

Yoshinobu Eishi, Moritaka Suga, Ikuo Ishige, Daisuke Kobayashi, Tetsuo Yamada, Tamiko Takemura, Touichiro Takizawa, Morio Koike, Shoji Kudoh, Ulrich Costabel, Josune Guzman, Gianfranco Rizzato, Marcello Gambacorta, Ronald du Bois, Andrew G. Nicholson, Om P. Sharma, and Masayuki Ando
Department of Human Pathology, School of Medicine, Tokyo Medical and Dental University, First Department of Internal Medicine, School of Medicine, Kumamoto University, Kumamoto, Department of Pathology, Japanese Red Cross Medical Center, Fourth Department of Internal Medicine, Nippon Medical School, Department of Pneumology and Allergology, Ruhrlandklinik, Essen, Department of General and Experimental Pathology, Bochum University, Bochum, Germany, Sarcoidosis Clinic, Institute of Pathology, Niguarda Hospital, Milan, Italy, Interstitial Lung Disease Unit, Department of Histopathology, Royal Brompton Hospital, London, England, Department of Medicine, School of Medicine, University of Southern California, Los Angeles, California 90033

Реферат

Причина саркоидоза остается неизвестной. В Европе подозреваются Mycobacterium spp., в Японии - Propionibacterium spp. Совместное международное исследование оценило возможные этиологические связи между саркоидозом и бактериальными агетами. Зафиксированные в формалине и залитые парафином образцы биопсии лимфатических узлов, один образец от каждого из 108 пациентов с саркоидозом и 65 пациентов с туберкулезом, вместе с 86 образцами группы контроля, были получены из двух институтов в Японии и трех институтов в Италии, Германии и Англии. Количество геномов Propionibacterium acnes, Propionibacterium granulosum, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium subsp., paratuberculosis и Escherichia coli (в качестве контроля) было подсчитано с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). P. acnes или P. granulosum были найдены во всех образцах. M. avium subsp. paratuberculosis не был найден ни в одном образце саркоидной ткани. M. tuberculosis была найдена в 0-9 % образцов саркоидной ткани, но в 65-100 % образцов ткани пациентов с туберкулезом. В саркоидных лимфатических узлах, общее количество геномов P. acnes или P. granulosum было гораздо больше количества геномов M. tuberculosis. P. acnes или P. granulosum были найдены в 0-60 % образцов ткани пациентов с туберкулезом и группы контроля, но общее количество геномов P. acnes или P. granulosum было меньше, чем в образцах саркоидной ткани. Propionibacterium spp. более вероятно чем Mycobacterium spp. вовлечены в этиологию саркоидоза, не только у Японских, но также у Европейских пациентов с саркоидозом.

Введение

Прошло более 100 лет с момента первого описания саркоидных повреждений Джонатаном Хатчинсоном, но причина этой системной гранулематозной болезни все еще остается неизвестной. Саркоидоз, возможно, является следствием воздействия специфического агента окружающей среды на наследственно восприимчивого индивидуума (13). Хотя подозревались многие инфекционные агенты, ни один из них не был идентифицирован. Подобие клинических, гистологических и иммунологических особенностей саркоидоза и туберкулеза, позволило предположить, что саркоидоз может быть атипичным видом туберкулеза; однако, Mycobacterium tuberculosis не была изолирована в саркоидных повреждениях. При использовании ПЦР, некоторые исследователи в Европе обнаружили микобактериальную ДНК в образцах вовлеченной ткани пациентов с саркоидозом (9, 23, 26), но другие не смогли этого сделать (2, 25, 29). Еще одно свидетельство микобактериальной причины саркоидоза было найдено Graham с коллегами, которые обнаружили сферобласты (бактерии с дефектом клеточной стенки) которые ревертировали к кислотостойким бактериям при культивировании из образцов биопсии кожи пациентов с саркоидозом (10). 5 из 6 изолянтов были Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (8).

В Японии, Propionibacterium acnes были культивированы из материалов биопсии 31 (78 %) из 40 лимфатических узлов 40 пациентов с саркоидозом (1). Количественная ПЦР позволила обнаружить большое количество геномов P. acnes или Propionibacterium granulosum в 15 биоптатах лимфатических узлов 15 Японских пациентов с саркоидозом (15). Эти результаты указывают на возможную этиологическую связь между пропионибактериями и саркоидозом. Действительно, P. acnes, сильный адъювант, вызывающий формирование гранулемы при введении чувствительным крысам (31) и кроликам (14). Однако, P. acnes в норме обнаруживаются в коже и кишечнике здоровых людей. P. acnes были изолированы в тканях 21 % из 180 образцов ткани пациентов с болезнями, иными чем саркоидоз (1) и были обнаружены в 2 (13 %) из 15 образцов лимфатических узлов при туберкулезе и в 3 (20 %) из 15 лимфатических узлов группы контроля с помощью количественной ПЦР (15).

В этом исследовании, образцы биопсии лимфатических узлов пациентов с саркоидозом и туберкулезом, вместе с образцами группы контроля, были получены из двух Японских институтов в Токио и Kumamoto и трех Европейских институтов в Италии, Германии и Англии. Геномы P. acnes, P. granulosum, M. tuberculosis, M. avium subsp. paratuberculosis и Escherichia coli (в качестве контроля) был подсчитаны. Мы сравнили частоты обнаружения и количество микобактериальной и пропионибактериальной ДНК в образцах из различных институтов и оценили возможную этиологическую связь между саркоидозом и этими бактериями.

Материалы и методы

Образцы ткани

В Японии, образцы были получены из Токио и Kumamoto, которые разделены расстоянием приблизительно 910 км. В Европе, образцы были получены из Niguarda Hospital, Milan, Italy; Ruhrlandklinik, Essen, Germany; и Royal Brompton Hospital, London, England. Образцы лимфатических узлов (один от каждого пациента) были зафиксированы в формалине и залиты парафином. Диагноз в каждом случае был установлен одним из авторов в институте, где был получен образец. Диагноз не был известен до окончания исследования. Диагноз саркоидоз был установлен при наличии характерной клинической картины, отсутствия текущей инфекции M. tuberculosis или других организмов, способных производить гранулематозную болезнь, и присутствии неказеозных гранулем в экземплярах биопсии вовлеченных тканей. Туберкулез был диагностирован согласно клиническим результатам, рентгенограмме и положительными результатами культурального исследования мокроты, БАЛ или образцов ткани, на которые воздействует казеозный некроз. У пациентов с подозреваемым внелегочным туберкулезом, была проведена биопсия увеличенных лимфатических узлов и был поставлен гистологический диагноз туберкулез, если были обнаружены гранулемы с центральным казеозным некрозом.

Материалы биопсии из Японии и Италии были получены из поверхностных лимфатических узлов. В Токио, имелось 24 пациента с саркоидозом, 13 пациентов с туберкулезом и 25 пациентов с неспецифическим лимфаденитом. В Kumamoto, имелось 19 пациентов с саркоидозом, 15 пациентов с туберкулезом и 15 пациентов с неспецифическим лимфаденитом. В Италии, имелось 17 пациентов с саркоидозом, 17 пациентов с туберкулезом и 16 пациентов с неспецифическим лимфаденитом. Материалы биопсии из Германии и Англии были получены из средостенных лимфатических узлов при медиастиноскопии. В Германии, имелось 33 пациента с саркоидозом, 5 пациентов с туберкулезом и 15 пациентов с раком легкого без метастазов. В Италии, имелось 15 пациентов с саркоидозом, 15 пациентов с туберкулезом и 15 пациентов с раком легкого без метастазов.

Результаты

Результаты для саркоидоза были следующие. Геномы P. acnes были найдены у 35 (81 %) Японских, 16 (94 %) Итальянских, 27 (82 %) Немецких и 15 (100 %) Английских пациентов. Геномы P. granulosum были найдены у 23 (53 %) Японских, 14 (82 %) Итальянских, 12 (36 %) Немецких и 10 (67 %) Английских пациентов. Не имелось никакого различия в частоте обнаружения P. acnes или P. granulosum между образцами биопсии из друх регионов Японии и среди образцов из четырех других стран, кроме более высокой частоты P. granulosum, обнаруженной у итальянских пациентов с саркоидозом. Геномы M. tuberculosis были найдены у от 0 до трех пациентов с саркоидозом в каждом из институтов. Геномы E. coli были найдены в повреждениях двух пациентов с саркоидозом.

Общее количество геномов P. acnes или P. granulosum, обнаруженных в лимфатических узлах при саркоидозе было намного выше, чем при M. tuberculosis, обнаруженных в тех же самых институтах (P < 0.001 во всех институтах).

Результаты для туберкулеза. Геномы P. acnes были найдены у 2 (7 %) Японских, 5 (29 %) Итальянских, 1 (20 %) Немецкого и 5 (33 %) Английских пациентов; геномы P. granulosum были найдены у 1 (4 %) Японского, 2 (12 %) Итальянских, 0 Немецких (0 %) и 5 (33 %) Английских пациентов. В группе контроля, геномы P. acnes были найдены у 8 (20 %) Японских, 3 (19 %) Итальянских, 5 (33 %) Немецких и 9 (60 %) Английских пациентов; геномы P. granulosum не были найдены у 0 Японцских, 3 (19 %) Итальянских, 3 (20 %) Немецких и 4 (27 %) Английских пациентов. Частота обнаружения P. acnes в группе контроля была выше в Англии, Японии или в Италии.

Общее количество геномов P. acnes или P. granulosum, обнаруженных у пациентов с туберкулезом и в группе контроля были более низкими, чем у пациентов с саркоидозом, кроме P. granulosum у пациентов из Германии. Большое количество геномов P. acnes было обнаружено у одного Английского индивидуума в группе контроля.

Геномы M. tuberculosis были найдены у 0 Японских пациентов с саркоидозом и у 6-9 % Европейских пациентов с саркоидозом, без существенных различий между институтами. Геномы M. tuberculosis были найдены у всех пациентов с туберкулезом их Токио и у 65-80 % пациентов с туберкулезом из других институтов.

Геномы M. avium subsp. paratuberculosis не были найдены.

Обсуждение

Имеется множество инфекционных агентов, которые производят гранулемы, походящие на саркоидные, включая микобактерии, вирусы герпеса, Histoplasma capsulatum, Treponema pallidum, Sporothrix schenckii, Coccidioides immitis, Schistosoma japonicum, Listeria monocytogenes, Rhodococcus spp. и агент болезни Уиппла. Саркоидоз распространен по всему миру, поэтому предполагаемая причина саркоидоза также должна быть широко распространена.

В качестве причинного агента саркоидоза предлагались: химические компоненты сосновой пыльцы (4), кислотостойкие организмы (28), микобактериофаги (19), некоторый неизвестный агент окружающей среды (20), Borrelia burgdorferi (11), M. tuberculosis (9, 23, 26) и человеческий вирус герпеса 8 (5). Однако, ни один из предложенных агентов не был изолирован в саркоидной гранулеме. B. burgdorferi была предложена как возможный агент саркоидоза группой Китайских исследователей (11) на основании увеличенного титра антител в сыворотке у пациентов с саркоидозом, но та же самая группа позже заключила, что увеличенный титр антител - неспецифический ответ (30). Человеческий вирус герпеса 8 был предложен группой Английских исследователей (5) на основании результатов ПЦР, но более позднее исследование другими группами (6, 16, 18) дало отрицательные результаты. По этим причинам, мы не искали B. burgdorferi или человеческий вирус герпеса 8 в нашем исследовании.

Грэм и его группа изолировали бактерии без клеточной стенки (сферобласты), которые ревертировали к M. avium subsp. paratuberculosis, из материалов биопсии кожи 6 из 9 пациентов с саркоидозом (8, 10). Напротив, мы не обнаружили геномы M. avium subsp. paratuberculosis в ни одном из образцов, независимо от их страны происхождения. Маловероятно, что мы не сумели обнаруживать ДНК M. avium subsp. paratuberculosis из-за низкой чувствительности метода обнаружения. Чувствительность метода позволяла обнаружить обнаружить по крайней мере 10 копий генома плазмиды (24). Чувствительность TaqMan ПЦР может объяснять обнаружение нескольких геномов P. acnes и E. coli в нескольких образцах группы контроля, потому что следы ДНК этих микроорганизмов могут присутствовать в смеси реакций, как предложено Moore (22) в случае человеческого вируса герпеса (8).

P. acnes были изолированы в образцах биопсии лимфатических узлов Японских пациентов с саркоидозом (1). В этом исследовании, P. acnes или P. granulosum были обнаружены во всех образцах пациентов с саркоидозом из Европы и Японии, за исключением двух. Возможное объяснение этих исключений - то, что первоначально они содержали эти геномы, но при подготовке экспериментов произошла денатурация ДНК. Одним из авторов, пропионибактерии были найдены во всех 12 образцах лимфатических узлов Американских пациентов с саркоидозом. Не имелось никакой связи между частотами обнаружения, числом геномов пропионибактерий, возрастом или полом у Японских пациентов.

P. acnes и P. granulosum - бактерии, обычно обнаруживаемые на здоровой коже, P. acnes первоначально были изолированы из угревых повреждений. Хотя это не прямая причина угрей, большое количество P. acnes имеется в сальных фолликулах. Число P. acnes на квадратном сантиметре кожи колеблется от 10² до 10⁶. P. granulosum имеет аналогичную локализацию с P. acnes, но присутствует в меньшем количестве. Возможность загрязнения пропионибактериями из кожи при проведении биопсии была исключена, потому что ДНК пропионибактерий была обнаружена только в саркоидных повреждениях. Присутствие организмов в тканях может рассматриваться как случайный факт, если обнаружены только несколько геномов. Возможность, что пропионибактерии могут присутствовать в ткани без патологических эффектов, была предположена результатами исследования (1). Геномы E. Coli были исследованы в качестве контроля, чтобы устранить возможность, что обнаруженные пропионибактерии не являются специфическими для болезни, и просто живут в хозяине. Только 2 из 108 образцов биопсии пациентов с саркоидозом содержали геномы E. coli. Имеется ли здесь этиологическая связь остается неясным, но пропионибактерии, находящиеся только в саркоидных повреждениях указывают, что нахождение этих бактерий анормально или они могут пролиферировать внутри саркоидных повреждений. Маловероятно, что формирование гранулемы может вызывать вторичную пролиферацию бактерий в повреждениях, потому что очень мало пропионибактерий было обнаружено в туберкулезных повреждениях, которые содержат гранулемы, подобные саркоидным.

Различия среди институтов в частотах обнаружения P. acnes или P. granulosum в образцах биопсии пациентов с саркоидозом не предполагают превалирование одной из разновидностей пропионибактерий у пациентов с различным генетическим фоном и различной окружающей средой. В образцах биопсии, в которых мы обнаружили геномы P. acnes или P. granulosum, гистологические особенности были одинаковы, независимо от того, геном какого организма был обнаружен.

Большая частота и большое число геномов пропионибактерий в группе с туберкулезом и группе контроля из Германии и Англии, по сравнению с группой из Японии и Италии, могут быть связаны с фактом, что только материалы из Германии и Англии были получены при биопсии средостенных лимфатических узлов. Мы исследовали 42 образца подмышечных лимфатических узлов (с и без раковых метастазов) 21 Немецкого пациента с раком легких и обнаружили геномы P. acnes только в 2 (5 %) образцах; геном P. granulosum обнаружен не был. Сравнение образцов биопсии средостенных и подмышечных лимфатических узлов в одном институте показало, что пропионибактерии были обнаружены с более высокой частотой в средостенный лимфатических узлах, причем число геномов было больше, чем в поверхностных лимфатических узлах, где саркоидные гранулемы могли быть обнаружены или не обнаружены. Эта находка предполагает, что пропионибактерии в норме живут не только на коже, но и в легких индивидуумах без саркоидоза.

Геномы M. tuberculosis не были найдены ни в одном из 43 образцов Японских пациентов с саркоидозом, но несколько геномов было найдено в 5 (8 %) из 65 образцов от Европейских пациентов с саркоидозом. В этих случаях, микобактерии могли бы играть определенную роль, но пропионибактерии, более вероятно причиняли воспаление, поскольку общее количество геномов пропионибактерий было намного больше, чем микобактериальных геномов. Микобактериальные геномы, найденные у пациентов без туберкулеза могли бы являться результатом вакцинирования бациллой Кальмета-Герена (БЦЖ) или латентной инфекции. На результаты, полученные на пороге чувствительности ПЦР, могут влиять многие факторы. Поэтому, предыдущие результаты (9, 17, 23, 26) успешного обнаружения микобактериальной ДНК, должны быть переоценены с помощью более чувствительных методов.

Множество геномов M. tuberculosis были найдены у 65-100 % пациентов с туберкулезом, и число геномов M. tuberculosis в этих образцах не очень сильно различалось от числа геномов P. acnes или P. granulosum в образцах пациентов с саркоидозом. Неудача обнаружения геномов M. tuberculosis в некоторых образцах пациентов с туберкулезом, может быть приписана различиям в объеме материала биопсии, содержащего казеозные гранулемы между институтами, поскольку материалы биопсии пациентов с туберкулезом имели различные размеры туберкулезных повреждений с центральным некрозом. Во всех образцах лимфатических узлов из Токио, на которые воздействует туберкулез, казеозные гранулемы занимали по крайней мере половину объема и геномы M. tuberculosis были обнаружены во всех образцах без исключения.

Основные концепции вирулентности и патогенности микроорганизмов недавно были пересмотрены Casadevall и Pirofski (3). Они подчеркивают, что общепринятое определение, что микроорганизмы патогенны, если вызывают болезнь у хозяина, неадекватно; некоторые микроорганизмы не вызывают клинически очевидную болезнь. Они предложили систему классификации таких патогенов, на основании их способности производить повреждение иммунной функции хозяина. Чтобы найти причину саркоидоза, мы должны рассматривать не только высоко патогенные бактерии типа микобактерий, но и эндогенные бактерии с низкой вирулентностью, такие как пропионибактерии. Постулаты Коха для экзогенной инфекции не могут применяться к болезни, вызванной эндогенными бактериями. Иммунологические реакции, такие как реакция Кумбса, могут причинять формирование гранулемы.

Воспалительный ответ при саркоидозе вовлекает активизированые T-клетки и макрофаги (12), с Th1 паттерном производства цитокина, что совместимо с Th1 иммунным ответом, вызванным все еще неизвестным антигеном (22). Если пропионибактерии причиняют саркоидоз, вероятно бактериальный антиген вызвает Th1 иммунный ответ. Ebe с коллегами (7) недавно сообщили, что рекомбинантный протеин P. acnes вызывал клеточный иммунный ответ у некоторых пациентов с саркоидозом, но не у индивидуумов без саркоидоза. Факторы хозяина могут быть намного более важными, чем этиологические факторы саркоидоза, что было предложено при исследовании теста Квейма (27), где подкожной введение саркодной ткани вызывает формирование саркоидной гранулемы у пациентов с саркоидозом, но не у здоровых индивидуумов или пациентов с другими болезнями. Саркоидоз может являться результатом Th1 иммунного ответа на один или большего количество антигенов у индивидуумов с наследственной или приобретенной ненормальностью иммунной системы.