Eur Respir J 2005; 26:77-85

Характеристики естественных киллеров и CD56+ T-клеток у пациентов с саркоидозом

K. Katchar, K. Soderstrom, J. Wahlstrom, A. Eklund and J. Grunewald
Dept of Medicine, Division of Respiratory Medicine, Karolinska Hospital, Stockholm, Sweden. Dept of Pathology, Stanford Medical School, Stanford, CA, USA.

Реферат

Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы изучить частоту, фенотип и функциональную активность естественных киллеров (NK) и CD56+ T-клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) и периферической крови пациентов с легочным саркоидозом по сравнению со здоровой группой контроля, с использованием окрашивания моноклональными антителами и проточной цитометрии. Результаты показали, что большинство субпопуляций легочных NK клеток экспрессировали CD56_BRIGHT. Напротив, в периферической крови пациентов и здоровой группы контроля наблюдается преобладание экспрессии CD56_DIM. Большинство легочных NK клеток экспрессировали C-тип лектин-подобного Е-специфического ингибирующего рецептора человеческого лейкоцитарного антигена (CD94/NKG2A), но только несколько легочных NK клеток экспрессировали иммуноглобулин-подобный ингибирующий рецептор, специфический для HLA-A, -B или -C молекул. Кроме того, значительно увеличенное число CD56+ T-клеток наблюдалось в крови пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля. При стимуляции in vitro, легочные NK и CD56+ T-клетки произвели значительное количество интерферона-гамма и фактора некроза опухоли альфа. Таким образом, в легких пациентов с легочным саркоидозом, был идентифицирован особый фенотип NK клеток, способных производить цитокины и активно участвовать в Th1 воспалительном ответе, связанном с саркоидозом.

Введение

Кроме цитотоксической функции, NK клетки способны секретировать широкий спектр про- и противовоспалительных цитокинов. Посредством этих функций, они, как известно, участвуют в защите хозяина против многих патогенов и опухолей (1). Согласно плотности экспрессии CD56, человеческие NK клетки в периферической крови могут быть разделены на две субпопуляции: CD56_BRIGHT и CD56_DIM. Менее численная субпопуляция CD56_BRIGHT способна производить существенные уровни воспалительных цитокинов (фактор некроза опухоли альфа и интерферон гамма) и может иметь важную роль в регулировании иммунного ответа. Субпопуляция CD56_DIM имеет сильную цитотоксичность, но практически не производит цитокины (2, 3).

Чтобы отличить нормальные клетки от патологических, NK клетки экспрессируют разнообразные активирующие и подавляющие рецепторы, которые регулируют их цитотоксичность и производство цитокинов. Подавляющие рецепторы главным образом сосредоточены в молекулах главного комплекса тканевой совместимости (MHC) класса I. Иммуноглобулин-подобные рецепторы NK клеток (KIRs) прежде всего распознают человеческие HLA-A, -B, -C или -G молекулы, принимая во внимание, что C-тип лектин-подобного рецептора (CD94/NKG2A) связывает HLA-E (4).

Активизированные T-клетки могут экспрессировать разнообразные рецепторы, которые также можно обнаружить на NK клетках, включая CD56, KIRs и CD94/NKG2A, которые очевидно связаны с различными эффекторными функциями. Например, рецептор CD56, обычно экспрессированный у T-клеток периферической крови, связан с цитолитическими эффекторными T-клетками, которые имеют цитотоксическое действие, не ограниченное MHC (5, 6). Большинство этих CD56+ T-клеток экспрессируют CD8 и более эффективно производят IFN-gamma, по сравнению с CD56- T-клетками (7).

Саркоидоз - гранулематозная болезнь неизвестной причины, которая наиболее часто поражает легкие. Предыдущие исследования распределения и функции NK клеток, использующие иммуногистологические методы, указали на изменение цитотоксической активности NK клеток в легких пациентов с саркоидозом (8-10). В нашем исследовании была определена частота NK и CD56+ T-клеток в ЖБАЛ и периферической крови пациентов с саркоидозом и здоровой группы контроля. Был проанализирован процент CD56_BRIGHT клеток (производящих цитокины) и CD56_DIM клеток (цитотоксических) в легком и периферической крови пациентов с саркоидозом и группы контоля. Кроме того, была определена экспрессия рецепторов KIRs и CD94/NKG2A у NK и CD56+ T-клеток в ЖБАЛ и периферической крови у пациентов с саркоидозом и группы контроля. Наконец, было исследовано производство цитокинов (IFN-gamma и TNF-alpha) этими субпопуляциями клеток после стимуляции in vitro.

Пациенты

Образцы ЖБАЛ и периферической крови были получены у 19 Скандинавских пациентов с саркоидозом (средний возраст 40 лет, диапазон 26-57 лет). Все пациенты имели клинические проявления и рентгенографические результаты, типичные для легочного саркоидоза. У всех пациентов была активная болезнь, диагностированная на основании раннее предложенных критериев (11). Восемь пациентов были женщинами, 11 мужчинами. Один из пациентов курил, 3 курили в прошлом и 15 никогда не курили. 16 пациентов имели гистологически подтвержденыый саркоидоз, 3 остальных пациента имели классический синдром Лёфгрена или отношение CD4+/CD8+ в ЖБАЛ > 4.0. Ни у одного пациента не проводилось терапии до проведения БАЛ. Продолжительность болезни определялаь как время от начала симптомов до проведения БАЛ.

Результаты

Субпопуляции NK и CD56+ T-клеток в ЖБАЛ и периферической крови

Проточная цитометрия экспрессии CD3 и CD56 использовалась, чтобы идентифицировать NK клетки (CD3-CD56+) и CD56+ T-клетки и определить их частоту в ЖБАЛ и периферической крови у пациентов с саркодозом и в группе контроля. Относительная частота NK клеток в ЖБАЛ (среднее значение 5.4 % (диапазон 3.6-6.8)) была значительно ниже по сравнению с периферической кровью (16.3 % (9.7-22.8)) у пациентов с саркоидозом (p < 0.001). Тот же самый паттерн был отмечен в ЖБАЛ (4.5 % (3.7-6.8) и периферической крови (13.1 % (10.0-19.3)) здоровой группы контроля (p < 0.001).

Существенного различия между частотой NK клеток в ЖБАЛ и периферической крови между пациентами и группой контроля не наблюдалось. Однако, имелось значительно большее количество CD56+ T-клеток в периферической крови пациентов (14.9 % (6.2-31.9)) по сравнению с группой контроля (5.7 % (3.7-7.0); p < 0.005), в то время как число CD56+ T-клеток в ЖБАЛ значительно не различались у пациентов (5.8 % (2.0-8.9) и группы контроля (3.6 % (2.3-5.8).

CD56_BRIGHT и CD56_DIM NK клетки в ЖБАЛ и периферической крови

При анализе частот субпопуляций CD56_BRIGHT и CD56_DIM NK клеток у пациентов, значительно большее количество CD56_BRIGHT NK клеток было найдено в ЖБАЛ (10.7 % (5.0-17.0)) по сравнению с периферической кровью (3.6 % (2.5-6.1) (p < 0.0005). Напротив, в группе контроля, число CD56_BRIGHT клеток в ЖБАЛ (2.1 % (0.9-4.5) было одинаково с периферической кровью (2.9 % (1.8-4.4). В соответствии с этими результатами, численность CD56_DIM в ЖБАЛ (89.3 % (82.8-95.0) была значительно меньше численности CD56_DIM NK клетки в периферической крови (95.6 % (93.9-96.7) у пациентов (p < 0.001), принимая во внимание, что в группе контроля, число CD56_DIM клеток было примерно одинаково в ЖБАЛ (98.0 % (95.5-99.2)) и периферической крови (96.5 % (94.4-97.9). Имелось значительно большее количество CD56_BRIGHT клеток в ЖБАЛ пациентов чем в группе контроля (p < 0.0005), принимая во внимание, что никаких различий не было найдено для PB CD56_BRIGHT NK клеток у пациентов и в группе контроля.

Экспрессия KIRs на NK и CD56+ клетках

Экспрессия рецепторов KIRs и CD94/NKG2 была оценена на NK и CD56+ T-клетках ЖБАЛ и периферической крови у 10 пациентов и у 7 индивидуумов группы контроля. У пациентов наблюдалось существенное уменьшение числа NK клеток в ЖБАЛ, экспрессирующих KIRs по сравнению с периферической кровью. Подобный паттерн наблюдался для CD56+ T-клеток. Напротив, рецептор CD94 был экспрессирован у значительно большей части NK клеток в ЖБАЛ, чем в периферической крови. У некоторых пациентов, эти рецепторы были исследовано отдельно, на наличие лектин-подобного рецептора C-типа NKG2A, то есть одного из трех NKG2 рецепторов, связывающих молекулу CD94. При исследовании каждого ингибирующего рецептора (p70, p58, KIR3DL2, CD94 и NKG2A) у 6 пациентов, было обнаружно, что p58 экспрессирован у меньшего числа NK клеток в ЖБАЛ по сравнению с периферической кровью (10.6 % (8.1-16.9) и 22.5 % (19.5-24.6), соответственно, (p < 0.05). C-тип лектин-подобного рецептора NKG2A был экспрессирован вместе с CD94 как гетеродимер и подобно CD94, был экспрессирован у большинства NK и CD56+ T-клеток в ЖБАЛ пациентов по сравнению с периферической кровью. Частота NK клеток, экспрессирующих рецепторы KIRs и CD94 в ЖБАЛ, была подобна периферической крови в группе контроля. Кроме того, экспрессия KIRs и CD94 на CD56+ T-клетках в ЖБАЛ по сравнению с периферической кровью группы контроля, не показало статистически значимого различия. Однако, имелась тенденция более низкого числа NK клеток, экспрессирующих KIRs и в ЖБАЛ и в периферической крови пациентов по сравнению с группой контроля (p = 0.09). Число NK и CD56+ T-клеток, экспрессирующих CD94 в ЖБАЛ и периферической крови, не различалось у пациентов и в группе контроля.

Производство цитокинов NK и CD56+ T-клетками

Стимуляция форболмиристатацетатом (PMA) и иономицином производства цитокинов NK клетками и CD56+ T-клетками была определена с помощью трехцветной проточной цитометрии у 4 пациентов. Большая часть NK клеток ЖБАЛ производила IFN-gamma (55.4 % (13.8-70.4)), по сравнению с (21.4 % (3.1-51.3)). Точно так же, доля NK клеток, производящих TNF-alpha, была увеличена в ЖБАЛ (42.1 % (21.9-57.1)), по сравнению с периферической кровью (0.3 % (0.3-18.5)). Кроме того, CD56+ T-клетки ЖБАЛ производили большее количество IFN-gamma (66.3 % (55.6-77.1)) и TNF-alpha (78.6 % (43.9-81.4)) по сравнению с периферической кровью (28.9 % (6.7-41.1) и 5.2 % (4.9-43.3)), соответственно.

Обсуждение

В этом исследовании, в ЖБАЛ и периферической крови пациентов с саркоидозом и здоровой группы контроля, были охарактеризованы две различные субпопуляции лимфоцитов, NK (CD3-CD56+) и CD56+ T-клетки. Была определена частота этих субпопуляций, фенотип относительно экспрессии KIRs и CD94/NKG2A рецепторов а также распределение CD56_BRIGHT и CD56_DIM NK клеток. Кроме того, была изучена способность этих клеток производить цитокины. По нашим данным, это первое исследование, где при саркоидозе использовался подобный экспериментальный подход.

В нашем исследовании был обнаружен относительно низкий процент NK клеток в ЖБАЛ по сравнению с периферической кровью, что согласуется с данными других авторов (8, 9, 17). Однако, у пациентов с саркоидозом, NK клетки в ЖБАЛ имели фенотипические отличия по сравнению с NK клетками в периферической крови. Малое число клеток экспрессировали KIRs, большинство клеток экспрессировали ингибирующий рецептор CD94/NKG2A. В отличие от предыдущих исследований, мы не обнаружили увеличенного числа NK клеток в периферической крови пациентов с саркоидозом (8, 9).

NK клетки могут производить цитокины, преобладающе IFN-gamma, и могут производить цитолиз целевых клеток без предшествующей стимуляции (18). Реактивность человеческих NK клеток контролируется ингибирующими рецепторами, специфическими для MHC класса I, включая KIRs и CD94/NKG2A. Эти рецепторы сначала были описаны на NK клетках и впоследствии на других субпопуляциях T-лимфоцитов. Они ингибируют процесс цитолиза целевых клеток NK клетками с нормальной экспрессией MHC класса I, но разрешают уничтожать клетки с девиацией экспрессии MHC класса I (19). Нарушение экспрессии KIR и/или отсутствие комплекса MHC класса I на поверхности нормальных клеток, могут иметь важное значение при аутоиммуннных болезнях (20). Экспрессия рецепторов KIRs и CD94 на субпопуляциях T-клеток ранее была изучена этими же авторами и показала увеличенное число CD8+CD94+ T-клеток в ЖБАЛ и уменьшение числа KIR+CD8+ T-клеток в ЖБАЛ по сравнению с периферической кровью, то есть паттерн, подобный описанному в настоящем исследовании NK клеток (21).

Увеличение численности субпопуляции CD94_HIGH KIR_low NK клеток в легком, может отражать привлечение этой специфической субпопуляции клеток с периферии, и эти NK клетки могут вносить вклад в местный иммунный ответ, секретируя Th1 цитокины. Agostini с коллегами (8) ранее продемонстрировали увеличение in vitro цитотоксической активности NK клеток в периферической крови пациентов с активным саркоидозом, принимая во внимание, что небольшая часть NK клеток в ЖБАЛ, была практически бездействующей.

Функция NK клеток, однако, не ограничена цитотоксичностью по отношению к опухоли или клеткам, инфицированным вирусом. Секреция IFN-gamma NK клетками также может вносить вклад в воспалительный Th1 ответ (18). Например, при ревматоидном артрите, NK клетки в синовиальной жидкости имеют увеличенную способность секретировать IFN-gamma в ответ на интерлейкин-12 и интерлейкин-15, по сравнению с NK клетками периферической крови (22). В нашем исследовании, анализ производства цитокинов NK клетками ЖБАЛ показал значительную способность NK клеток производить IFN-gamma и TNF-alpha. Даже при том, что T-клетки имеют главную роль в патогенезе саркоидоза, вероятно, что NK клетки и CD56+ T-клетки также вносят вклад в воспаление при саркоидозе, активизируя макрофаги посредством производства цитокинов.

NK клетки могут быть разделены на две субпопуляции, согласно плотности поверхностной экспресии CD56, то есть, CD56_BRIGHT и CD56_DIM (23). CD56_BRIGHT NK клетки, обычно составляют относительно малую часть NK клеток, и они имеют преимущественно иммунорегуляторную функцию, реализуемую посредством производства цитокинов. CD56_BRIGHT NK клетки экспрессируют меньшие уровни KIRs и увеличенные уровни CD94/NKG2A, которые являются характерными особенностями этой субпопуляции. Наоборот, CD56_DIM клетки экспрессируют высокие уровни KIRs, но низкие уровни CD94 рецепторов, и функциональные исследования показали, что субпопуляция CD56_DIM является в большей степени цитотоксической (1). В нашем исследовании, была изучена частота CD56_BRIGHT и CD56_DIM клеток в ЖБАЛ и периферической крови пациентов и здоровой группы контроля. Мы обнаружили, что у пациентов с саркоидозом, частота CD56_BRIGHT NK клеток в ЖБАЛ была значительно выше, по сравнению с периферической кровью, и NK клетки в легком чаще экспрессируют CD94 и реже KIRs, чем NK клетки периферической крови. Это поддерживает гипотезу, что NK клетки, которые накапливаются в легких пациентов с саркоидозом, принадлежат к другой субпопуляции NK клеток, то есть. CD56_BRIGHTCD94_HIGHKIR_low, которые способны производить большое количество цитокинов IFN-gamma и TNF-alpha, но имеют меньшую цитотоксическую активность. Фактически, численность субпопуляции CD56_BRIGHT NK клеток значительно больше в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом по сравнению с ЖБАЛ группы контроля, что указывает на участие этих клеток в саркоидном воспалительном процессе. Было показано, что CD56_BRIGHT NK клетки в больших количествах находятся на участках воспаления и могут взаимодействовать с другими мононуклеарными клетками, усиливая воспалительный процесс.

CD56+ T-клетки имеют цитолитические способности и могут демонстрировать цитотоксичность, не ограниченную MHC (5, 6). Большинство CD56+ T-клеток экспрессируют CD8 и более эффективно производят IFN-gamma, по сравнению с CD56- T-клетками (7). Однако, функциональная роль CD56+ T-клеток, кроме их цитотоксичности, не известна. Тем не менее, они могут иметь специфическую роль в иммунорегуляции. Их часто обнаруживают в печени (24).

Существенно увеличенное число CD56+ T-клеток и экспрессирующих KIR CD56+ T-клеток в ЖБАЛ было найдено в периферической крови пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля. Также имелось большее количество производящих IFN-gamma и TNF-alpha CD56+ T-клеток в ЖБАЛ по сравнению с периферической кровью. Уместность наших заключений может быть поводом для дискуссии; однако, увеличенное число CD56+ T-клеток в периферической крови пациентов с саркоидозом может говорить, что субпопуляция CD56+ T-клеток может играть важную роль в регулировании иммунного ответа при саркоидозе, хотя необходимы дальнейшие исследования других цитокинов, чтобы понять роль этой субпопуляции лимфоцитов при саркоидозе.