International Immunology, Vol. 16, No. 2, pp. 215-222, February 2004

Нарушение производства IFN-gamma Valpha 24 NKT клетками при неремиттирующем саркоидозе

Seiichiro Kobayashi, Yoshikatsu Kaneko, Kenichiro Seino, Yoshihito Yamada, Shinichiro Motohashi, Junzo Koike, Kaoru Sugaya, Takayuki Kuriyama, Shigetaka Asano, Tomiyasu Tsuda, Hiroshi Wakao, Michishige Harada, Satoshi Kojo, Toshinori Nakayama and Masaru Taniguchi
Departments of Molecular Immunology, Respirology and Medical Immunology, Graduate School of Medicine, Chiba University, Chiba 260-8670, Japan Laboratory for Immune Regulation, RIKEN Research Center for Allergy and Immunology, Yokohama 230-0045, Japan PRESTO, Japan Science and Technology Corp., Saitama 332-0012, Japan Division of Molecular Therapy, Institute of Medical Science, University of Tokyo, Tokyo 113-0033, Japan Third Department of Internal Medicine, Oita Medical University, Oita 879-5593, Japan

Реферат

Саркоидоз - системная болезнь, связанная с формированием гранулем, характеризованная патологическим производством Th1 цитокинов и накоплением Th1 CD4 T-клеток в гранулематозных повреждениях, предполагая важность Th1 ответа при саркоидозе. Однако, патогенез саркоидоза остается неизвестным. Мы исследовали Valpha24 NKT клетки, имеющие иммунорегуляторную функцию при саркоидозе. У пациентов с неремиттирующим саркоидозом наблюдалось уменьшение числа Valpha24 NKT клеток в периферической крови и накопление этих клеток в гранулематозных повреждениях. При стимулировании специфическим гликолипидным лигандом, альфа-галактозилкерамидом, Valpha24 NKT клетки периферической крови пациентов с неремиттирующей болезнью, производили нормальные уровни IL-4, но значительно меньшее количество IFN-gamma, чем клетки здоровых добровольцев. Уменьшение производства IFN-gamma наблюдалось только у Valpha24 NKT клеток, но не у обычных CD4 T-клеток пациентов с неремиттирующим саркоидозом, но было нормальным у пациентов с разрешением болезни, предполагая, что в развитии неремиттирующего саркоидоза участвует недостаточное производство IFN-gamma Valpha24 NKT клетками, что хорошо коррелирует с активностью болезни. Таким образом, эти результаты предполагают, что Valpha24 NKT клетки играют важную роль в течении саркоидоза.

Введение

NKT клетки являются уникальной субпопуляцией лимфоцитов, характеризованной экспрессией специфических маркеров NK клеток и инвариантного антигенного рецептора, кодируемого сегментами гена Valpha14 и Jalpha281 у мышей (1) и Valpha24 и JalphaQ у людей (2,3). Активизированные Valpha14 и Valpha24 NKT клетки производят IFN-gamma и IL-4 (4-6), нарушение баланса которых было связано с развитием болезни. Valpha14 NKT клетки имеют регулирующие функции, которые защищает от развития аутоиммуннных болезней, таких как диабет первого типа у мышей (7,8) и связаны с лучшим результатом при трансплантации (9,10). Сообщалось, что Valpha14 NKT клетки защищают от развития микобактериальной инфекции и последующего ответа хозяина в виде формирования гранулем при инфекции Mycobacterium tuberculosis (11).

Саркоидоз - системная болезнь, патологическим признаком которой является неказеозная гранулема (12). Проявления саркоидоза изменяются от бессимптомной болезни с патологией рентгенограммы легких до прогрессирующей болезни с мультиорганной недостаточностью. Течение болезни болезни может быть самоограниченным и хроническим, последняя форма не склонна к ремиссии. Хотя точный патогенез саркоидоза остается неясным, предполагается, что клеточный иммунный ответ против неизвестного антигена ведет к формированию гранулемы у генетически предрасположенного хозяина (13). Несколько исследований указали на увеличенные уровни Th1 цитокинов в ЖБАЛ (14) и накопление Th1 CD4 T-клеток в гранулемах (15,16), предлагая важность Th1 ответа в патогенезе саркоидоза и эрадикацию неизвестного саркоидного антигена.

Мы исследовали функцию Valpha24 NKT клеток у пациентов с разрешившимся и неремиттирующим саркоидозом. Мы использовали мышиные Valpha14 NKT клетки для измерения антиген-презентирующей способности и выполнили ПЦР для обнаружения производства цитокинов. Наши результаты говорят, что уменьшение числа Valpha24 NKT клеток и низкое производство IFN-gamma хорошо связаны со статусом болезни.

Пациенты

Диагноз легочного саркоидоза был установлен у всех пациентов на основании клинических критериев с гистологическим подтверждением наличия неказеозных гранулем при биопсии (17). Пациенты не принимали стероиды или другие противовоспалительные средства во время проведения исследования. Пациенты были классифицированы следующим образом. Пациенты с разрешившимся саркоидозом: патология на рентгенограмме легких исчезла, улучшилась или оставалась устойчивой в течение 3 месяцев наблюдения. Пациенты с неремиттирующим саркоидозом: патология на рентгенограмме легких флюктуирует или ухудшается. Статус болезни был определен следующим образом. Устойчивая болезнь: патология рентгенограммы легких исчезла, улучшилась или оставалась устойчивой в течение 3 месяцев наблюдения. Активная болезнь: патология на рентгенограмме легких флюктуирует или ухудшается. У некоторых пациентов с саркоидозом было произведено исследование повреждений скелетных мышц с целью обнаружения скопления NKT клеток в повреждениях. Все пациенты дали информироованное согласие на участие в исследовании. Исследование было одобрено комитетом по этике.

Результаты

Уменьшение производства IFN-gamma Valpha24 NKT клетками при неремиттирующем, но не при разрешившимся саркоидозе

Известно, что Valpha24 NKT клетки производят цитокины, которые регулируют различные аспекты иммунного ответа. Поэтому, мы искали функциональные дефекты производства цитокинов Valpha24 NKT клетками при саркоидозе. Из-за небольшого числа Valpha24 NKT клеток в образцах, мы выполнилнили полуколичественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскриптазой (RT-PCR) после селективной экспансии Valpha24 NKT клеток in vitro. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) были культивированы с IL-2 и alpha-GalCer (4), чтобы увеличить число Valpha24 NKT клеток, и затем с помощью сортировки клеток по флюоресцентным меткам (FACS) Valpha24+Vbeta11+ клетки стимулировались форболмиристатацетатом (PMA) и иономицином, чтобы стимулировать производство цитокинов. Уровни IFN-gamma мРНК Valpha24 NKT клеток были значительно уменьшены у пациентов с неремиттирующим саркоидозом по сравнению с пациентами с разрешившейся болезнью и группой контроля. Однако, существенного уменьшения уровней мРНК IL-4 не наблюдалось ни в одной из групп, что указывает на селективное нарушение секреции Th1 цитокинов (то есть IFN-gamma) у Valpha24 NKT клеток у пациентов с неремиттирующим саркоидозом.

Чтобы исследовать, является ли дисфункция производства IFN-gamma событием, специфическим для Valpha24 NKT клеток, мы выполнили RT-PCR на уровне отдельных клеток. Для этого PBMC стимулировались иммобилизированными Anti-CD3 моноклональными антителами и затем у Valpha24+Vbeta11+ клеток была исследована экспрессия гена IFN-gamma с помощью RT-PCR. Процент производящих IFN-gamma клеток среди Valpha24 NKT клеток у пациентов с неремиттирующим саркоидозом был значительно меньше, чем у пациентов с разрешившимся саркоидозом. Эти результаты указывают, что Valpha24 NKT клетки у пациентов с неремиттирующим саркоидозом имеют уменьшенную способность по производству IFN-gamma.

Затем мы исследовали производство цитокинов у обычных CD4 T-клеток. В отличие от Valpha24 NKT клетоки, CD4 T-клетки демонстрировали нормальное производство IFN-gamma и/или IL-4 во всех трех группах. Не было обнаружено существенных различий в пропорции прооизводящих IFN-gamma, IL-4- и IFN-gamma/IL-4 клеток. Эти результаты указывают, что производство цитокинов CD4 T-клетками не нарушено и что уменьшение производства IFN-gamma является специфическим для Valpha24 NKT клеток при неремиттирующем саркоидозе.

Уменьшение числа Valpha24 NKT клеток при неремиттирующем саркоидозе

Мы также сравнили число Valpha24 NKT клеток и CD3+ клеток у пациентов с разрешившимся и неремиттирующим саркоидозом. Процент Valpha24 NKT клеток в субпопуляции CD3+ клеток был значительно уменьшен у пациентов с неремиттирующим саркоидозом по сравнению с пациентами с разрешившимся саркоидозом и группой контроля. Абсолютное число Valpha24 NKT клеток также было существенно уменьшено у пациентов с неремиттирующим саркоидозом. Напротив, процент CD3+ T-клеток у пациентов с неремиттирующим саркоидозом значительно не отличлся от пациентов с разрешившимся саркоидозом и группой контроля. Таким образом, у пациентов с неремиттирующим саркоидозом наблюдается уменьшение числа Valpha24 NKT клеток. Число Valpha24 NKT клеток было более низким при активной болезни, по сравнению устойчивой болезнью. Однако, число CD3+ T-клеток было неизменным в большинстве случаев, независимо от статуса болезни. Когда число Valpha24 NKT клеток в периферической крови было сравнено с числом Valpha24 NKT клеток в ЖБАЛ у 6 пациентов с разрешившимся и неремиттирующим саркоидозом, имелась существенная корреляция их числа в периферической крови и ЖБАЛ у всех, кроме одного пациента.

Функция антиген-презентирующих (APC) клеток у пациентов с неремиттирующим саркоидозом

Так как число Valpha24 NKT клеток у пациентов с неремиттирующим саркоидозом значительно уменьшено, мы исследовали, происходит ли это уменьшение из-за функционального дефекта у APC или у Valpha24 NKT клеток. Для этого мы исследовали CD1d-зависимую антиген-презентирующую способность APC с использованием alpha-GalCer в качестве суррогата антигена. Мы не обнаружили существенных различий среди трех групп по способности APC стимулировать мышиные Valpha14 NKT клетки, указывая, что они функционируют норамльно.

Накопление Valpha24 NKT клеток в саркоидных гранулемах

Мы оценили накопление Valpha24 NKT клеток в саркоидных гранулем, измеряя число копий транскриптов гена Valpha24-JalphaQ и Calpha с помощью полуколичественной RT-PCR. Сначала мы лимфатические узлы пациента с легочным саркоидозом с внутригрудными лимфатическими узлами пациента с раком легкого в качестве контроля. Процент Valpha24 NKT клеток (Valpha24-JalphaQ) среди общего количества T-клеток (Calpha) был значительно выше в лимфатических узлах пациента саркоидозом, чем у пациента с раком легкого. Мы также обнаружили, что процент Valpha24 NKT клеток в гранулемах скелетных мышц пациентов с саркоидозом был чрезвычайно высоким по сравнению с нормальными тканями группы контроля. Эти данные говорят, что при саркоидозе наблюдается накопление Valpha24 NKT клеток в гранулематозных повреждениях.

Экспрессия цитокинов в саркоидных гранулемах

Мы оценили экспрессию цитокинов в саркоидной гранулеме с помощью полуколичественной RT-PCR. Экспрессия IFN-gamma была значительно выше в гранулемах лимфатического узла пациента с саркоидозом, по сравнению с пациентом с раком легкого. Что касается IL-4, никаких существенных различий обнаружено не было. Увеличение экспрессии IFN-gamma было большим в гранулемах скелетных мышц пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля. Так как в гранулеме лимфатического узла наблюдалось примерно в 100 раз, а в гранулеме мышцы примерно в 2 раза больше T-клеток по сравнению с Valpha24 NKT клетками, основным источником IFN-gamma были Th1 T-клетки, что согласуется с другими исследованиями (14-16). Какой вклад вносят Valpha24 NKT клетки в обнаруженную секрецию IFN-gamma, точно не известно.

Обсуждение

Несмотря неизвестную этиологию, многие свидетельства указывают, что саркоидоз связан с серьезной иммунологической дисфункцией (12,24). Хотя Valpha24 NKT клетки производят большое количество цитокинов и управляют балансом Th1/Th2 иммунного ответа, относительно их роли в патогенезе саркоидоза у людей известно мало. С другой стороны, в исследовании мышей, формирование гранулем, индуцированных фосфатидил-инозитол-маннозидазой M. tuberculosis было нарушено у Valpha14 NKT-дефицитных (Jalpha281-/-) мышей (11), предполагая, что Valpha14 NKT клетки играют первичную роль в гранулематозном ответе. Кроме того, дисфункция NKT клеток ведет к развитию аутоиммуннных болезней, например диабета первого типа у мышей или в модели экспериментального энцефаломиелита у мышей (25,26). Поэтому, мы выдвинули гипотезу, что человеческие Valpha24 NKT клетки вносят вклад в модуляцию прогресса болезни и формирования неказеозных гранулем при саркоидозе.

Факторы, которые инициируют саркоидоз или модулируют его прогресс, остаются неизвестными. Аналогично, пока невозможно предсказать, у каких пациентов болезнь будет самоограниченной а у каких будет неуклонно прогрессировать, приводя к серьезному покражению ткани. Некоторые свидетельства говорят, что саркоидоз происходт при воздействии агентов окружающей среды на наследственно восприимчивого хозяина. Триггер саркоидоза может быть инфекционным и не инфекционным (17). Недавно сообщалось, что грамм-положительные бактерии, Propionibacterium acnes и Propionibacterium granulosum, являются возможными антигенами, вызывающими формирование гранулем при саркоидозе (13).

Увеличенная экспрессия Th1 цитокинов в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом и накопление CD4 T-клеток в гранулемах, предполагает участие Th1 CD4 T-клеток в патогенезе болезни (14-16). Однако, наше исследование показало, что CD4 T-клетки периферической крови пациентов с саркоидозом производят нормальные или немного большие количества IFN-gamma по сравнению с группой контроля. Таким образом, уменьшенное производство IFN-gamma является специфической особенностью Valpha24 NKT клеток при неремиттирующим саркоидозе. Кроме того, нормальные уровни производства IFN-gamma у Valpha24 NKT клеток пациентов с разрешившимся саркоидозом вместе с накоплением этих клеток в гранулемах, говорят, что производство IFN-gamma Valpha24 NKT клетками может управлять активностью болезни. Поскольку IFN-gamma, произведенный NKT клетками существенно влияет на баланс Th1/Th2 иммунного ответа (27), дисфункция Valpha 24 NKT клеток у пациентов с неремиттирующим саркоидозом может вести к недостаточному Th1 ответу, приводящему к неремиттирующей болезни.

Mempel с коллегами (28) сообщили об отсутствии Valpha24 NKT клеток в кожных повреждениях при саркоидозе. Напротив, наши эксперименты показали существенное накопление Valpha24 NKT клеток в гранулемах при легочном и костно-мышечном саркоидозе. Причина подобного несоответствия неизвестна, но это может происходить из-за различия стадии саркоидоза, исследуемых тканей или чувствительности методов обнаружения Valpha24 NKT клеток. В этом отношении, мы недавно обнаружили, что активация Valpha14 NKT клеток стимулирует быстрое уменьшение экспрессии рецептора Valpha14. Возможно, что продолжительное воздействие неизвестного тригера на Valpha24 NKT клетки у пациентов с саркоидозом вызывает уменьшение экспрессии рецептора Valpha24, которая может быть обнаружена с помощью ПЦР, но не при окрашивании с помощью антител.

В любом случае, уменьшение числа Valpha24 NKT клеток и их производство IFN-gamma, участвуют в прогрессировании саркоидоза. Практическая польза этих наблюдений заключается в том, что анализ числа Valpha24 NKT клеток и их функции при саркоидозе может быть полезным при оценке прогноза болезни. Наши результаты также указывают на новую терапевтическую стратегию при лечении саркоидоза, например активацию Valpha24 NKT клеток лигандом гликолипида. Для оценки этой возможности необходимы дальнейшие исследования.