Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., Volume 22, Number 6, June 2000 672-675

Ген естественного связанного с резистентностью белка макрофагов у афро-американцев с саркоидозом

Mary J. Maliarik, Kang Mei Chen, Roberta G. Sheffer, Benjamin A. Rybicki, Marcie L. Major, John Popovich Jr., and Michael C. Iannuzzi
Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Department of Internal Medicine, and Department of Biostatistics and Research Epidemiology, Henry Ford Health Sciences Center, Detroit, Michigan

Реферат

Гистологические и клинические подобия между туберкулезом и саркоидозом предполагают общую патофизиологию. Человеческий естественный связанный с резистентностью белок макрофагов (NRAMP1), тесно связанный с мышиным геном, связан с восприимчивостью к туберкулезу в некоторых группах пациентов. Учитывая важность гена NRAMP1 в животной модели гранулематозных болезней, связью с туберкулезом у человека и возможной ролью NRAMP1 в активации макрофагов, мы выдвинули гипотезу, что NRAMP1 играет важную роль в восприимчивости к саркоидозу. Мы проанализировали несколько полиморфизмов гена NRAMP1 в исследовании 157 афро-американских пациентов с саркоидозом и 111 афро-американцев в группе контроля. Наши результаты, в отличие пациентов с туберкулезом, показали, что менее обычные генотипы чаще были найдены в группе контроля, чем у пациентов (OR 0.48; 95% CI 0.28-0.81). В частности, было обнаружено, что один полиморфизм, (CA)(n) в 5' регионе гена, имеет протективный эффект (P = 0.014). Принимая во внимание, что полиморфизмы NRAMP1 были связаны с увеличением восприимчивости к туберкулезу, наши результаты предполагают, что по крайней мере один полиморфизм NRAMP1 может уменьшать восприимчивость к саркоидозу.

Введение

Считается, что саркоидоз является реакцией на некоторый неизвестный антиген. Было предложено несколько экологических факторов. Например, ряд исследований предположили более высокую частоту у больных с саркоидозом инфекций Mycobacterium tuberculosis (1, 2), Mycobacterium orale (3) и вируса Эпштейна-Барра (4, 5). Микобактериальная ДНК и РНК были обнаружены в саркоидных тканях, используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР) (6), хотя об изоляции этих организмов не сообщалось. Единственный ясно идентифицированный фактор риска саркоидоза - раса. В США, афро-американцы имеют саркоидоз более часто (11) и имеют более высокую распространенность семейного саркоидоза и большую тяжесть болезни (10, 17). Harrington с коллегами (17) описал 91 семью с вовлечением более чем одного органа и сообщил, что семейный саркоидоз был более обычным у афро-американцев (17 %) чем у белых (6 %). Превалирование саркоидоза в некоторых этнических группах и семейная группировка предполагают, что генетическая восприимчивость может играть важную роль в этиологии саркоидоза.

Устойчивость к микобактериальным инфекциям также является наследственно детерминированной. Понятие, что существует наследственная восприимчивость к туберкулезу, поддерживается сообщениями о семейной группировке туберкулеза в эндемических областях, исследованиями конкордантности (схожести) монозиготных и дизиготных близнецов и очевидном влиянии этнических факторов на распространенность и серьезность микобактериальной инфекции (18). В США, афро-американцы имеют в два раза больше чем белые риск инфекции Mycobacterium tuberculosis (22, 23). Исследование восприимчивости к микобактериальной инфекции на мышиной модели показало, что единственный ген, названный Lsh/Ity/Bcg, увеличивает восприимчивость к внутриклеточным патогенам, таким как лейшмания, сальмонелла и микобактерии (24). Макрофаги гомозиготных мутантных мышей показывают ряд специфических дефектов при уничтожении опухолевых клеток и антимикробной активности (25). Исследователи идентифицировали ген, названный геном естественного связанного с резистентностью белком макрофагов (NRAMP1), который кодирует политопный, макрофаг-специфический мембранный белок, функция которого, возможно, включает мембранный транспорт (26). Единственная мутация, приводящая к замене аспартата на глицин в позиции 169, является ответственной за устойчивость к инфекции внутриклеточными паразитами у мышей. Последующее клонирование и исследование гена человеческого NRAMP1, показали 88% идентичность с геном мыши (27, 28). В частности, глицин, ответственный за устойчивость к инфекциям у мышей, сохраняется у человека. Недавнее исследование обнаружило связь NRAMP1 с восприимчивостью к туберкулезу в гамбийской популяции (29) и слабую связь с семейной воспииимчивостью (30).

Функциональное исследование показало, что NRAMP1 участвует в начальной стадии прайминга и активации макрофагов. NRAMP1 может иметь много эффектов на функцию макрофагов, включая сверхрегуляцию фактора некроза опухоли альфа, IL-1beta и экспрессию главного комплекса гистосовместимости класса II (25, 31). Провоспалительные цитокины TNF-alpha и IL-1beta являются важными медиаторами формирования гранулем. Об увеличенной экспрессии TNF-alpha (32), IL-1beta (33, 34) и HLA-DR (35) сообщалось для саркоидных альвеолярных макрофагов.

Участие NRAMP1 в активации макрофагов делает его привлекательным геном-кандидатом для саркоидоза. Мы проверили, наблюдаются ли четыре полиморфизма NRAMP1 более часто у афро-американских пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля.

Пациенты

Это исследование было одобрено наблюдательным советом Henry Ford Health System Institutional. Группа состояла из 157 афро-американских пациентов с саркоидозом и 111 здоровых афро-американцев в группе контроля. Пациенты были привлечены в исследование из числа пациентов с саркоидозом Henry Ford Hospital Pulmonary Clinic. Диагноз саркоидоз был подтвержден гистологически, негативным окрашиванием и культуральными исследованиями для кислотостойких организмов и грибов. 70 % пациентов были женщинами. В момент проведения исследования пациенты имели возраст от 26 до 73 лет, средний возраст 49 ± 11 лет. Саркоидоз был диагностирован в среднем за 13 ± 10 лет до проведения исследования и время наблюдения в клинике составляло по крайней мере 1 год. Средний возраст пациентов при постановке диагноза был 36 ± 9 лет, диапазон от 19 до 59 лет. Группа контроля состояла служащих клиники, не имевших никаких легочных болезней во время исследования и близких родственников с саркоидозом. Группа контроля имела средний возраст 39 ± 10 лет, 78% были женщинами. Все пациенты дали информированное согласие на участие в исследовании.

Фенотипирование

Клинический курс каждого случая саркоидоза был определен при рассмотрении истории болезни. На основании клинических особенностей, 140 из 157 пациентов были категоризированы в одну из трех фенотипических категорий:

Легкая: случайное обнаружение патологии рентгенограммы, нормальная функция органов, нелеченная болезнь, бессимптомная после 1 - 2 года наблюдения или острое начало симптомов со спонтанной ремиссией в течение 2 лет. Умеренная: симптоматическая болезнь с минимальными ненормальностями функции органов, с или без прооведения терапии. Тяжелая: прогрессирующая болезнь с дисфункцией органов и признаками фиброза.

Результаты

Из 5 проанализированных локусов, перекрывающих ген NRAMP1, четыре в исследуемой группе афро-американцев были полиморфными. Пятый локус, обозначенный A318V, не был полиморфным в этой группе. Мы наблюдали статистически значимое различие в распределении частоты аллеля 5'(CA)n между пациентами и группой контроля (P = 0.014). По сравнению с общей 120 bp аллелем, другие аллели редко наблюдались в группе пациентов с саркоидозом, предполагая, что полиморфизм на этом участке связан с уменьшением риска саркоидоза. D543N аллель находится в неравновесном сцеплении с 3' UTR del аллелем, таким образом эти результаты, не были независимы друг от друга. D543N G/3' UTR del гаплотип наблюдался в афро-американской популяции, но не был харатерен для белых и азиатов (35). D543N G/3' UTR del гаплотип также наблюдался у Западных Африканцев (27). Объединенный анализ 5'(CA)n и D543N G полиморфизмов, показал увеличение протективного эффекта. Объединенный анализ INT4 и 3' UTR вариантов, которые были сильно связаны с туберкулезом (27), не показал никакого эффекта у больных с саркоидозом.

140 пациентов были категоризированы в одну из трех фенотипических категорий: легкую (n = 50), умеренную (n = 57) и тяжелую (n = 33). Мы обнаружили, что в умеренной категории, ассоциация D543N аллели с уменьшением риска саркоидоза была намного более сильной (OR, 0.20; 95 % CI, 0.05-0.81) чем в полной группе (OR 0.63; 95 % CI, 0.32-1.22), но малый размер группы не дает возможность сделать статистически значимые выводы.

Обсуждение

Некоторые характеристики NRAMP1 делают этот ген привлекательным кандидатом, ответственным за восприимчивость к саркоидозу. NRAMP1 экспрессирован исключительно у макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов. Главной функцией NRAMP1 может быть транспорт заряженных молекул. NRAMP1 также имеет близкую гомологию с другими транспортными белками, включая транспортер нитрата у Aspergillus (26). Это предполагает, что NRAMP1 может транспортировать нитрат внутриклеточно, чтобы синтезировать закись азота, которая участвует в антимикробной активности. Эксперименты по трансфекции гена in vitro (31, 40) поддерживают мнение, что NRAMP1 участвует в ранней активации макрофагов.

Подобие между саркоидозом и туберкулезом побудили нас исследовать NRAMP1 как ген-кандидат восприимчивости к саркоидозу. Наблюдаемый уменьшенный риск саркоидоза контрастирует с результатами, полученными в исследовании туберкулеза. Bellamy с коллегами (29) оценили 5'(CA)n, INT4, D543N и 3' UTR полиморфизмы у 800 Западных Африканцев и сообщили о сильной связи между полиморфизмами NRAMP1 и увеличением риска туберкулеза (29). Сегрегационный анализ 98 бразильских семей (30), также предположил небольшое влияние локуса NRAMP1. Это исследование саркоидоза и туберкулеза предполагает, что NRAMP1 играет роль в гранулематозном воспалении легкого.

Гипотеза, что микобактерии играют роль в патогенезе саркоидоза, продолжает обсуждаться. Недавние исследования, используя методы с увеличенной чувствительностью для обнаружения микобактериальной ДНК в саркоидной ткани, не смогли окончательно разрешить вопрос. Popper с коллегами (9) сообщил об обнаружении микобактериальной ДНК в материалах биопсии 11 из 35 пациентов с саркоидозом, в то время как Vokurka с коллегами (41) не обнаружили микобактериальной ДНК в материалах биопсии пациентов с саркоидозом, используя ПЦР. Ishige с коллегами (10) обнаружили микобактериальную ДНК у 3 из 15 пациентов с саркоидозом и ДНК пропионовокислых бактерий у 12 из 15 пациентов с саркоидозом. Исследование генов, участвующих в устойчивости этим организмам, может вести к большему пониманию роли, которую возбудители инфекций играют при саркоидозе.

Считается, что саркоидоз начинается с процессинга антигена макрофагами с последующей презентацией антигена Т-лимфоцитам. Активизированные Т-лимфоциты инициируют процесс, который включает секрецию цитокинов и факторов роста, привлечение и дифференцирование воспалительных клеток и формирование гранулемы. Макрофаги у больных с саркоидозом имеют необычно высокую способность презентировать антиген, вследствие увеличенной экспрессии HLA на поверхности клеток (35). Дополнительная экспрессия антигенпрезентирующих молекул и провоспалительных цитокинов саркоидными макрофагами, может быть результатом увеличенной активации NRAMP1. Дифференциальная активация макрофагов различными аллелями NRAMP1 может влиять на клинический курс саркоидоза. Наши результаты предполагают, что по крайней мере один полиморфизм NRAMP1 связан с уменьшенным риском саркоидоза у афро-американцев, поддерживая потенциальную роль NRAMP1 в восприимчивости к саркоидозу.