The Journal of Immunology, 1999, 162: 1024-1031

Остеопонтин связан с T-клетками в саркоидных гранулемах и имеет адгезивные и цитокин-подобные свойства in vitro

Anthony W. O'Regan, Geoffrey L. Chupp, John A. Lowry, Margo Goetschkes, Niall Mulligan and Jeffrey S. Berman
Pulmonary Center and Department of Pathology, Boston University School of Medicine, Boston, MA 02188; and Boston Veterans Affairs Medical Center, Boston, MA 02130

Реферат

Саркоидоз - системная болезнь, характеризованная накоплением активизированных T-клеток и формированим гранулем. Для этой болезни важной является генетическая предрасположенность индивидуума. Остеопонтин, неколлагеновый матриксный протеин, производится макрофагами и T-лимфоцитами, экспрессирован в гранулемах при туберкулезе и связан с генетической восприимчивостью к внутриклеточным инфекциям. Функция остеопонтина в T-клеточном ответе неизвестна. Мы стремились объяснить роль остеопонтина в гранулематозном воспалении, характеризуя его экспрессию в различных стадиях саркоидоза и его эффекторные функции in vitro. Экспрессия остеопонтина при саркоидозе, исследованная с помощью иммуногистохимических методов, коррелировала со зрелостью гранулемы. Кроме того, остеопонтин вызвал хемотаксис Т-клеток, стимулировал адгезию T- клеток (эффект увеличивался дроблением остеопонтина тромбином) и стимулировал пролиферацию Т-клеток. Эти результаты предполагают новый механизм, с помощью которого остеопонтин и тромбин модулируют привлечение и активацию Т-клеток в процессе гранулематозного воспаления.

Введение

Саркоидоз - хроническая гранулематозная болезнь неизвестной причины (1). В Соединенных Штатах заболеваемость у белых составляет 5 на 100,000, у афро-американцев 50 на 100,000 (1). Этиология и патогенез саркоидоза изучены плохо. Болезнь рассматривается как T-клеточный воспалительный ответ на неизвестные антигенные стимулы, и, по крайней мере в некоторых случаях, генетическая предрасположенность определяет восприимчивость к болезни и ее серьезность (2, 3). Многие исследования были направлены на идентификацию специфического антигенного стимула, связанного с саркоидозом. Однако, вероятно, что независимо от вовлеченного антигенного стимула, интенсивность гранулематозного ответа значительно влияет на тяжесть заболевания и смертность при этой болезни. Поэтому, понимание факторов восприимчивости и серьезности саркоидоза могут облегчить разработку терапевтических и профилактических стратегий.

Остеопонтин (OPN) - неколлагеновый адгезивный матриксный белок, обычно обнаруживаемый в кости и на эпителиальных поверхностях, который содержит обязательный мотив (последовательность нуклеотидов) аргинин-глицин-аспартат (RGD), обычный для многих белков внеклеточного матрикса (ECM) (4, 5, 6). В отличие от других матриксных белков, OPN содержит участок дробления, смежный с RGD областью, который изменяет адгезивную способность OPN (7, 8, 9). In vitro, OPN стимулирует интегрин- и CD44-управляемую адгезию клеток, хемотаксис остеокластов, клеток гладких мышц, моноцитов и B-лимфоцитов (10, 11, 12, 13, 14, 15). Была исследована роль OPN в процессах резорбции кости, малигнизации, формировании атероматозных бляшек и кальцинозе воспаленных и поврежденных тканей (5, 16, 17, 18, 19).

Недавно полученные данные предположили новую роль OPN в иммунном ответе. Он действует как регулирующий фактор для макрофагов, T-клеток и NK-клеток (20, 21). Подкожное введение OPN стимулирует миграцию макрофагов и in vitro стимулирует адгезию и миграцию моноцитов (13, 22). Кроме того, экспрессия OPN макрофагами и T-клетками в кальцинированных искусственных клапанах сердца говорит, что OPN может играть роль в процессе дистрофического кальциноза (19).

OPN также важен для генетической резистентности к внутриклеточным патогенам (20). У мышей, ген OPN был картирован в том же самом локусе, где находится медиатотр естественной резистентности к внутриклеточному патогену Rickettsia tsutsugamushi. Аллели этого гена, которые инициируют раннее производство OPN в ответ на R. tsutsugamushi, связаны с восприимчивостью к болезни (20). Недавно была описана экспрессия OPN на участках формирования гранулемы при туберкулезе и силикозе и его увеличенная экспрессия у альвеолярных макрофагов, инфицированных микобактериями (23, 24). Функция OPN при гранулематозном воспалении неизвестна. Поэтому, мы стремились охарактеризовать in vivo экспрессию OPN в саркоидных гранулемах и определять in vitro влияние OPN на функции Т-клеток.

В этом сообщении, мы описываем экспрессию OPN в саркоидных гранулемах при легочном саркоидозе и обращаем внимание на характерный паттерн окрашивания лимфоцитов. На основании этих наблюдений, мы охарактеризуем влияние OPN на функции Т-лимфоцитов in vitro. OPN связывается с T-клетками, стимулирует адгезию и хемотаксис Т-клеток и стимулируют пролиферацию покоящихся Т-клеток в ответ на лигирование антигенных рецепторов. Адгезия модулируется дроблением остеопонтина тромбином. Эти данные показывают, что OPN является T-клеточным, RGD-содержащим белком с цитокин/хемокин-подобными функциями и что его взаимодействие с Т-клетками модулируется дроблением тромбином. Поэтому возможно, что OPN может регулировать интенсивность саркоидного гранулематозного воспаления посредством привлечения и иммобилизации T-лимфоцитов.

Результаты

Лимфоцит-ассоциироованная экспрессия OPN в саркоидной гранулеме

Экспрессия OPN была изучена в материалах открытой биопсии легкого 6 пациентов с легочным саркоидозом. Эти пациенты имели различную демографию, клинические индексы активности болезни и результаты рентгенограммы и представляли различные стадии легочного саркоидоза, от ранней активной болезни до терминальной стадии. Ткань была окрашена с анти-OPN (клон MPIIIB10) или контрольным изотипом (клон QH1) (21, 23). В саркоидных гранулемах была замечена обширная экспрессия OPN. У всех пациентов наблюдалось преобладающее окрашивание периферических областей гранулем, богатых лимфоцитами. Мы обнаружили интенсивное окрашивание CD3+ клеток (T-лимфоциты). Ядро гранулемы, содержаще макрофаги, эпителиоидные клетки и многоядерные гигантские клетки также показало окрашивание OPN, однако, значительно более слабое, чем у лимфоцитов. ECM не окрашивались. Никакого окрашивания не было замечено при использовании контрольного изотипа. Чтобы определить специфичность экспрессии OPN при воспалительных болезнях легкого, мы окрашивали материалы биопсии легкого 4 пациентов с острым респираторным дистресс-синдромом (ARDS), медиатором которого являются нейтрофилы. В отличие от обширной экспрессии OPN при саркоидозе, при ARDS OPN был замечен только в эпителии дыхательных путей и у отдельных макрофагов. Как мы сообщали ранее, окрашивание эпителия дыхательных путей замечено в воспаленным, но не в нормальном легком (23).

Экспрессия OPN при саркоидозе коррелирует со зрелостью гранулемы

Экспрессия OPN была определена в гранулемах, в зависимости от их зрелости. Ранние и промежуточные гранулемы, экспрессировали как клеточные, так и матриксные элементы и показали OPN окрашивание лимфоцитов и гистиоцитов, но не матрикса. Поздние фиброзные гранулемы показали значительно меньшую экспрессию OPN, которая была ограничена многоядерными гигантскими клетками. Этот паттерн отличался от замеченного при окрашивании фибронектина (FN), другого матриксного белка с имммуномодулироющими функциями, который экспрессирован при саркоидозе (26, 33). FN был обнаружен в клеточных и стромальных элементах, как в пределах так и в окружении гранулем. Кроме того, окрашивание FN было замечено во всех гранулемах, независимо от их зрелости. Никакого окрашивания не было замечено при использовании контрольного изотипа. Эти данные демонстрируют, что экспрессия OPN больше в ранних саркоидных гранулемах и что этот паттерн экспрессии отличается от паттерна экспрессии FN.

OPN стимулирует хемотаксис T-клеток

Матриксные белки могут модулировать функцию лимфоцитов (34). На основании иммунореактивности OPN в областях Т-клеточных гранулем и известной способности OPN стимулировать миграцию моноцитов у мышей, мы предположили, что OPN может модулировать миграцию человеческих T-клеток (12, 13). Способность OPN стимулировать хемотаксис Т-клеток была проанализирована, используя модифицированную камеру Boyden при концентрациях OPN от 150 ng/ml до 16 µg/ml (2.5-250 nM). Эксперимент был повторен 3 раза, с хорошей повторяемостью. Во всех экспериментах, пик миграции был замечен при концентрации 2-4 µg/ml (30-60 nM), хотя в двух экспериментах существенная миграция была отмечена при концентрациях менее 150 ng/ml. Возможно, что это два различных типа хемотаксиса, определяемые различными рецепторами. Величина хемотаксиса, производимого OPN, была подобна хемотаксису производимому другими хемоаттрактантами лимфоцитов, такими как RANTES и IL-16.

Активизированные T-клетки, но не покоящиеся T клетки, связываются с OPN-покрытыми поверхностями

Для привлечения T-клеток к участкам воспаления необходимы скоординированная миграция клеток и адгезия. Продемонстрировав существование OPN-индуцированного хемотаксиса Т-клеток, мы проверили способность OPN стимулировать адгезию клеток. Хотя покоящиеся T-клетки не адгезировались к иммобилизированному OPN, активация форболмиристатацетатом привела к существенной адгезии T-клеток к OPN. Три эксперимента показали, что при концентрации 5 µg/ml OPN, 27±6 % форболмиристатацетат-активизированных T-лимфоцитов адгезировались к OPN. Требование активации форболмиристатацетатом - признанное явление, обычное для рецепторов интегрина и облегчает адгезию с помощью группировки или изменения аффинности молекул адгезии на поверхности клеток (35, 36).

Дробление тромбином увеличивает адгезию Т-клеток к OPN

Ввиду способности T-клеток адгезироваться к OPN и известного модуляционного эффекта дробления остеопонтина тромбином на адгезию клеток опухоли к OPN, мы проверили гипотезу, что дробление тромбином OPN увеличивает адгезию Т-клеток по сравнению с нормальным OPN. 4 эксперимента показали, что дробление OPN тромбином стимулирует адгезию большего процента T-клеток (60±15 %, p < 0.05) чем нормальный OPN (35±5 %). Поэтому, OPN - мощный субстрат для адгезии T-клеток и эта адгезия положительно модулируется дроблением тромбином.

OPN костимулирует пролиферацию Т-клеток

Показав, что OPN экспрессирован у T-клеток при саркоидозе, болезни характеризованной хронической активацией и пролиферацией Т-клеток, мы предположили, что OPN модулирует пролиферацию Т-клеток. Аnti-CD3 mAb обеспечивает сигнал для пролиферации Т-клеток, который может быть увеличен соответствующими костимулами. Мы наблюдали, что OPN заметно усилил этот пролиферативный ответ. Хотя высокие концентрации Anti-CD3 mAb вызвали некоторую пролиферацию Т-клеток, в более низких дозах пролиферация было незначительной. При всех концентрациях Anti-CD3 mAb, присутствие иммобилизированного OPN привело к существенной пролиферации Т-клеток. Несмотря на существенные вариации степени пролиферации, несколько экспериментов показали, что пролиферативный ответ в присутствии OPN был в 2-7 раз больше, чем при воздействии только Anti-CD3 mAb (n = 10, 4.5±2.5 раз). Хотя изменчивость в величине пролиферации между экспериментами делает невозможным сравнение потенции различных костимулятотров in vitro, ответ на OPN был подобен ответу, наблюдаемому при Anti-CD3 mAb, объединенными с фибронектином или форболмиристатацетатом (26, 28).

Обсуждение

OPN рассматривается как матриксный белок из-за наличия RGD мотива (5). Однако, он имеет много других свойств, уместных для воспаления и клеточного иммунного ответа, которые говорят, что OPN в этих ситуациях ведет себя скорее как цитокин (20, 21, 23, 37). В этой статье, мы продемонстрировали Т-клеточную иммунореактивность OPN в саркоидных гранулемах. Кроме того мы охарактеризовали его модулирующие эффекты на функцию Т-клеток in vitro, уместные для аккумуляции и активации Т-клеток при саркоидозе.

При саркоидозе, начальный гранулематозный ответ производит скоординированную миграцию и адгезию макрофагов и активизированных T-клеток (38). Скоординированная экспрессия, время и место скопления различных компонентов ECM могут влиять и регулировать этот ответ. Мы идентифицировали OPN в основном в богатых T-клетками областях саркоидных гранулем и отметили, что экспрессия OPN была ограничена или отсутствовала при фиброзе. Так как и макрофаги и активизированные T-клетки могут производить OPN, неясно, представляет ли окрашивание адгезию Т-клеток к произведенному макрофагами OPN, или это de novo экспрессия OPN T-лимфоцитами (20, 21). Эти результаты говорят, что при саркоидозе OPN может взаимодействовать с T-клетками и модулировать их функцию. Кроме того, более явная экспрессия OPN в активных гранулемах, поддерживают раннюю роль OPN в формировании гранулемы.

Экспрессия OPN в гранулемах отличалось от экспрессия фибронектина, другого матриксного белка, который активизирует адгезию и пролиферацию Т-клеток (26). В отличие от экспрессии OPN, фибронектин преобладающе был связан с ECM. Кроме того, в отличие от OPN, фибронектин был обнаружен в матриксе как клеточных воспалительных гранулем, так и в бесклеточных фиброзных гранулемах. Это различие экспрессии фибронектина и OPN говорит, что OPN и фибронектин могут функционировать по-разному при гранулематозном ответе.

В то время как OPN может быть выгоден в ранем гранулематозном ответе, персистирующая экспрессия OPN может вносить вклад в тяжесть болезни. OPN, наряду с другими белками матрикса кости, регулирует минерализацию скелета (16). Фактически, OPN имеет и положительное и отрицательное влияние на кальциноз ткани (19). Дистрофический кальциноз, при которым воспаленные или поврежденные ткани ''затвердевают'', является скоординированным клеточным ответом, регулируемым неколлагеновыми ECM компонентами (19). Было показано, что при этом ответе, экспрессия OPN коррелирует с инфильтрацией ткани макрофагами и T-клетками и ее последующим кальцинозом (19). Дистрофический кальциноз происходит при некоторых хронических гранулематозных болезнях легкого и связан с существенной дисфункцией ткани. Хотя дистрофический кальциноз редок при саркоидозе, возможно, персистирующая экспрессия OPN может быть детерминантом минерализации ткани легкого при гранулематозном воспалении.

Мы показали, что OPN стимулирует хемотаксис и адгезию человеческих T-клеток. Наши данные говорят, что OPN может участвовать в привлечении и адгезии T-клеток и моноцитов на ранней стадии формирования гранулемы и может стимулировать взаимодействия клеток, важные для активации Т-клеток (13, 14, 22). Наши иммуногистохимические результаты говорят, что OPN может быть важным фактором на раннем этапе формирования гранулемы. Другие исследования показали, что отсутствие раннего OPN ответа, связано с восприимчивостью к инфекции R. tsutsugamushi у мышей, что макрофаги отвечают на Mycobacterium tuberculosis ранним производством OPN, и что OPN является основным ранним белком, произведенным активизированными T-клетками (20, 23, 37).

Адгезия T-клеток к OPN увеличивается при дроблении остеопонтина тромбином. Предыдущие исследования, оценивающие регулирование активности OPN, сообщили о противоречивых результатах. Одно исследование сообщило, что тромбин уменьшил RGD-индуцированную адгезию к рекомбинантному человеческому и нативному OPN (9). Другое исследование показано, что дробление нативного человеческого OPN увеличивает адгезию к разнообразным линиям клеток, включая фибробласты, клетки гладких мышц и клетки опухоли (7). Было показано, что N-терминальный фрагмент, который содержит RGD мотив, поддерживает адгезию линии клеток человеческой меланомы (8). Наши данные согласуются с двумя последними исследованиями и поддерживают роль тромбина в увеличении адгезии Т-клеток к OPN. Противоречивые результаты исследований не обязательно являются взаимоисключающими. OPN содержит еще один участок дробления тромбином в пределах RGD мотива, и возможно, что различные состояния дробления тромбином или вариабельность доступа к этому участку могут прерывать RGD последовательность и быть медиатором адгезии (8). Кроме того, так как OPN может связывать множество рецепторов, которые дифференциально экспрессированы на различных клетках и линиях клеток, возможно, что некоторые взаимодействия усиливаются, в то время как другие ингибируются. Наши данные показывают, что тромбин увеличивает адгезию Т-клеток к OPN in vitro.

Экспрессия OPN при гранулематозных болезнях и роль тромбина в регулировании адгезии OPN имеют интересное значение в патогенезе формирования гранулемы. Имеются вполне достаточные данные, позволяющие предположить, что активный тромбин и ''прокоагулянтная активность'' следуют за формированием гранулемы. При легочном саркоидозе были продемонстрированы увеличенная прокоагулянтная активность бронхоальвеолярного лаважа и присутствие циркуляции Д-димеров (39, 40). Кроме того, Perez (41) сообщил, что мыши, восприимчивые к стимулирующему формирование гранулем M. tuberculosis, имели увеличенную прокоагулянтную активность, в то время как невосприимчивые мыши имели увеличенную активность активатора плазминогена. Вместе с нашими данными это говорит, что активация адгезивных свойств T-клеток указывет на новую роль тромбина в формировании гранулемы и что иммуномодуляционные эффекты системы коагуляции частично могут быть реализованы через взаимодействие с OPN. Влияние ингибирования коагуляции на гранулематозное воспаление неизвестно, хотя лечение гепарином ингибировало аллергические реакции задержанного типа (42).

Костимуляция пролиферации OPN - свойство, общее с другими матриксными белками (34). Способность фибронектина, ламинина и гиалуроновой кислоты к костимулированию пролиферации Т-клеток через различные рецепторы, говорит, что различные компоненты ECM могут иметь специфические иммунномодуляционные эффекты (26, 43). Хроническая активация и пролиферация Т-клеток - необходимый компонент саркоидного гранулематозного воспаления (38). Экспрессия OPN при саркоидозе и его способность к костимуляции T-клеток предполагает другой механизм, с помощью которого пролиферация Т-клеток может быть увеличена в пределах саркоидных гранулем.

Самая ранняя обнаруженная патология при саркоидозе - мононуклеарные инфильтраты, состоящие из T-лимфоцитов и макрофагов/моноцитов (38). Считается, что производство специфических гранулемогенных факторов, координирует этот процесс (38). В то время как формирование гранулемы вероятно отражает сложное взаимодействие цитокинов, взаимодействие клетка-клетка и клетка-матрикс, идеальный гранулемогенный фактор должен производиться в больших количествах с самого раннего этапа формирования гранулемы, персистировать в течение воспаления и уничтожаться, когда воспаление уменьшается. Это стимулировало бы хемотаксис и последующую адгезию, активацию и пролиферацию привлеченных воспалительных клеток. Наши данные показывают, что OPN обладает многими из свойств идеального гранулемогенного фактора. Кроме того, известная связь наследственно детерминировванной экспрессии OPN и восприимчивость к внутриклеточным инфекциям у мышей говорит, что различные аллели гена OPN могут определять генетическую восприимчивость и патогенез гранулематозного иммунного ответа, включая саркоидоз. Наконец, связь между каскадом коагуляции и активностью OPN предполагают новый терапевтический подход к саркоидозу, используя антикоагулянты, ингибиторы генерации и активации тромбина.