Journal of Leukocyte Biology. 2003;74:295-301

Высокая экспрессия p21^Waf1 в саркоидных гранулемах: предполагаемая роль в продолжительном воспалении

Jordi Xaus, Nuria Besalduch, Monica Comalada, Joaquim Marcoval, Ramon Pujol, Juan Mana and Antonio Celada
Group of Macrophage Biology, Institute of Biomedical Research of Barcelona-Barcelona Science Park, Spain; and Departments of Dermatology and Medicine, Ciutat Sanitaria i Universitaria de Bellvitge, University of Barcelona, Spain

Реферат

В саркоидных гранулемах процесс апоптоза отсутствует, что может объяснять длительное воспаление. Мы исследовали молекулярные механизмы игибирования апоптоза в саркоидных гранулемах и обнаружили, что IFN-gamma ингибирует апоптоз макрофагов посредством экспрессии p21^Waf1. Мы проанализировали материалы биопсии кожи 19 пациентов с саркоидоза и 16 индивидуумов группы контроля. ПЦР с обратной транскриптазой (RT-PCR) не показала различий в экспрессии проапоптических (Bax и Bcl-Xs) или антиапоптических (Bcl-2 и Bcl-XL) генов, ни в экспрессии гена супрессора опухоли p53. Кроме того, была проанализирована экспрессия IFN-gamma, p21^Waf1 и p27^Kip1. Экспрессия IFN-gamma была обнаружена у 37 % пациентов с саркоидозом, в группе контроля экспрессии обнаружено не было (P < 0.02). 58 % пациентов экспрессировали p21^Waf1, против 12 % в группе контроля (P < 0.005). Имелась существенная корреляция между экспрессией IFN-gamma и p21^Waf1 (r=0.69) и между экспрессией p21^Waf1 и экспрессией фибронектина (r=0.65). Наконец, используя иммуногистохимический анализ, мы обнаружили высокую реактивность p21^Waf1 внутри гранулемы. Мы считаем, что высокие уровни p21^Waf1 при саркоидозе могут объяснять отсутствие апоптоза в гранулеме и персистирование воспаления.

Введение

Саркоидоз - мультисистемная, гранулематозная болезнь неизвестной этиологии, которая наиболее часто поражает легкие, средостенные и периферические лимфатические узлы, кожу, печень, селезенку, глаза и околоушные железы. Менее часто саркоидоз поражает центральную нервную систему, сердце, верхний респираторный тракте и кости [1]. Болезнь характеризуется формированием неказеозных гранулем в пораженных органах. Саркоидные гранулемы являются компактной и высоко динамичной структурой, которая состоит центральной группы мононуклеарных фагоцитов, макрофагов, эпителиоидных и гигантских клеток, которая как правило окружена лимфоцитами, главным образом CD4+ T-клетками и небольшим числом CD8+ T- и B-клеток [2, 3].

У большинства пациентов, болезнь спонтанно разрешается в пределах 2 лет или после лечения кортикостероидами без персистирования воспаления или фиброза, но в некоторых случаях развивается хроническая, прогрессирующая болезнь [4]. Однако, 2 года являются слишком большим сроком для разрешения воспалительного ответа. В нормальных условиях, воспалительный ответ обычно разрешается в течение нескольких дней, что позволяет избежать значительного порвреждения ткани. В большинстве случаев, разрешение воспалительных повреждений происходит при апоптозе активизированных клеток [5, 6]. В иммунной системе, за процесс апоптоза ответственны Fas антиген и Fas лиганд [6, 7]. Экспрессия сигнальных рецепторов апоптоза, фактора некроза опухоли I (TNFR I) и Fas, на альвеолярных макрофагах при саркоидозе увеличена [8], однако в саркоидных гранулемах было обнаружено очень мало апоптических клеток [9, 10, 11]. В отличие от саркоидоза, апоптические клетки наблюдаются при других болезнях легкого, например, при интерстициальной пневмонии или идиопатическом легочном фиброзе [9].

Отсутствие апоптоза внутри саркоидной гранулемы, может объяснять большую продолжительной жизни клеток, участвующих в воспаление. В этом контексте, мы стремилось исследовать молекулярные механизмы, которые могли бы объяснить отсутствие апоптоза в гранулеме, несмотря на воспаление и экспрессию Fas и других рецепторов.

Активация макрофагов интерфероном гамма (IFN-gamma) или их адгезия к внеклеточному матриксу (ECM) приводит к подавлению апоптоза [12, 13]. Этот антиапоптический эффект связан с экспрессией ингибитора циклин-зависимой киназы (cdk) p21^Waf1 [12], который участвует в регулировании апоптоза в нескольких клеточных моделях [14, 15]. Поскольку макрофаги и IFN-gamma играют важную роль в развитии саркоидных гранулем [16, 17], мы исследовали, эквивалентны ли наши исследования апоптоза макрофагов in vitro, исследованиям in vivo патологии человека.

С помощью полуколичественной ПЦР с обратной транскриптазой (RT-PCR), мы впервые наблюдали, что p21^Waf1 и фибронектин сильно экспрессированы в кожных саркоидных гранулемах и что увеличение их экспрессии коррелировало с увеличением уровней IFN-gamma, наблюдаемом у пациентов с саркоидозом. Эти результаты указывают, что экспрессия p21^Waf1 может быть связана с отсутствием апоптоза внутри саркоидной гранулемы и таким образом с увеличением времени жизни клеток, формирующих гранулему.

Пациенты

Саркоидоз был диагностирован у 19 индивидуумов (8 с острым и 11 с хроническим саркоидозом) в соответствии с классическими критериями: совместимая клиническая и радиологическая картина; демонстрация наличия неказеозных гранулем в одном или более количестве органов с отрицательным окрашиванием и культуральными исследованиями для микобактерий и грибов или положительный результата теста Квейма и исключение других гранулематозных болезней [1]. Диагноз кожного саркоидоза был подтвержден присутствием неказеозных гранулем в материале биопсии кожи. Саркоидоз классифицировался как острый, когда ремиссия болезни происходила в течение менее 2 лет и хронический, когда активность болезни сохранилась в течение более 2 лет после постановки диагноза [4]. У всех пациентов была выполнена диагностическая биопсия, часть материала использовалась для целей исследования. Ни один пациент не получал кортикостероиды во время проведения исследования. В группе контроля, изучалась 16 биопсий нормальной кожи. Информированное согласие было получено у каждого участника исследования.

Результаты

Хотя в литературе могут быть найдены противоречивые данные относительно процесса апоптоза при саркоидозе, считается, что в саркоидных гранулемах процесс апоптоза нарушен, что объясняет длительное воспаление и увеличение времени жизни клеток, формирующих гранулему [9 10 11]. Мы исследовали молекулярные механизмы, которые могут участвовать в ингибировании апоптоза. Для этой цели, мы исследовали материалы биопсии кожи 35 индивидуумов (8 пациентов с острым, 11 пациентов с хроническим саркоидозом, 16 группа контроля). Образцы были исследованы с помощью полуколичественной RT-PCR, используя олигонуклеотиды, специфические для 11 генов. Поскольку никаких различий в экспрессии всех исследованных генов при хронической и острой форме саркоидоза найдено не было, эти две группы были объединены.

Сначала, мы исследовали некоторые гены семейства Bcl-2 и экспрессию гена супрессора опухоли p53, поскольку известно, что эти гены участвуют в регулировании процесса апоптоза [20 21 22]. Для этой цели, мы изучали экспрессию проапоптических генов Bax и Bcl-X_s или антиапоптических генов типа Bcl-2 и Bcl-X_L. Из-за ослабления процесса апоптоза в саркоидных гранулемах, мы ожидали обнаружить увеличение экспрессии антиапоптических генов или уменьшение экспрессии проапоптических генов. Однако, экспрессия этих генов была очень низкой во всех случаях и никаких различий не наблюдались между группой контроля и пациентами с саркоидозом, что указывает, что гены семейства Bcl-2 и ген p53 не связаны с ингибированием апоптоза, наблюдаемого при саркоидозе.

Известно, что при саркоидозе наблюдается увеличение экспрессии Fas и TNFR [8]. Поскольку эти две молекулы являются рецепторами, связанными с развитием апоптоза, механизм, который защищает гранулему от апоптоза, должен действовать посредством ингибирования этих рецепторов. Известно, что IFN-gamma ингибирует апоптоз макрофагов, индуцированный LPS или TNF-alpha. Для этого необходимо увеличение экспрессии p21^Waf1 и ингибирование клеточного цикла [12, 23]. Поскольку макрофаги играют важную роль в развитии гранулемы [16] и при саркоидозе наблюдается увеличение числа клеток Т-хелпер, секретирующих Th1 цитокины, главным образом IFN-gamma [17, 24], мы измерили экспрессию IFN-gamma и ингибиторов cdk p21^Waf1 и p27^Kip1.

Экспрессия IFN-gamma была обнаружена в 37 % биопсий пациентов с саркоидозом и в 0 % в группе контроля (P < 0.02), что подтверждает ранее полученные данные [17, 24]. Кроме того, частота экспрессии p21^Waf1 (P < 0.005) была значительно выше у пациентов с саркоидозом, чем в группе контроля. У пациентов с саркоидозом и в группе контроля наблюдалась высокая частота экспрессии p27^Kip1 (84 % и 62 %, соответственно). Уровни экспрессии IFN-gamma коррелировали с уровнем экспрессии p21^Waf1.

В предыдущих исследованиях in vitro, мы наблюдали, что протеогликан декорин внеклеточного матрикса некоторых тканей, защищает макрофаги от апоптоза [13]. В механизме антиапоптического действия декорина участвует p21^Waf1, способ его действия аналогичен нашим наблюдениям относительно IFN-gamma [13]. Учитывая высоко структурированную конфигурацию саркоидной гранулемы, адгезия с компонентами внеклеточного матрикса может быть критически важной для формирования гранулемы [25]. Кроме того, декорин - мощный ингибитор фиброгенеза [26] вследствие чего саркоидоз обычно разрешается без фиброза. Поэтому мы исследовали, участвуют ли компоненты внеклеточного матрикса в патогенезе саркоидной гранулемы.

У 50 % индивидуумов группы контроля наблюдались существенные уровни экспрессии декорина. Существенных различий экспрессии декорина с пациентоми с саркоидозом не наблюдалось (42 %). Никаких различий также не было найдено в частоте экспрессии коллагена типа IV (87 % и 79 % в группе контоля и у пациентов с саркоидозом, соответственно). Однако, существенное различие наблюдалось в числе пациентов, которые экспрессировали высокие уровни фибронектина (P < 0.005). Хотя экспрессия этого белка была очень низкой в группе контроля, высокий уроовень экспрессии фибронектина был обнаружен в 50 % биопсий кожи пациентов с саркоидозом. Экспрессия фибронектина хорошо коррелировала с экспрессией генов p21^Waf1 и IFN-gamma у пациентов с саркоидозом.

Наши результаты указывают, что саркоидные гранулемы демонстрируют увеличение экспрессии IFN-gamma, p21^Waf1 и фибронектина, что может объяснять увеличение времени жизни клеток, формирующих гранулему и поэтому быть связанным с патогенезом болезни. Чтобы установить, было ли увеличение экспрессии этих генов местным эффектом внутри гранулемы или системным, мы проанализировали экспрессию этих генов у мононуклеарных клеток периферической крови у некоторых пациентов. Как и ожидалось, увеличение экспрессии этих генов было местным, наблюдалось только в саркоидной гранулеме и не затрагивало циркулирующие иммунные клетки.

Чтобы подтвердить возможное участие p21^Waf1 в ингибировании апоптоза внутри саркоидной гранулемы, мы выполнили иммуногистохимическое окрашивание материалов биопсии. Хотя высокая экспрессия p21^Waf1 была обнаружена внутри гранулемы, она не была обнаружена в смежной ткани. Чтобы выяснить источник экспрессии p21^Waf1 внутри гранулемы, мы произвели окрашивание Anti-CD14 и Anti-CD45 антителами, которое показало, что эти клетки имеют макрофагальное происхождение. Эти результаты подтверждают результаты RT-PCR и участие p21^Waf1 в патогенезе саркоидоза кожи.

Наконец, чтобы подтвердить, что иммунные клетки с высокими уровнями экспрессии p21^Waf1 внутри гранулемы являются макрофагами, мы проанализировали in vitro экспрессию p21^Waf1, индуцированную IFN-gamma у нескольких типов клеток, входящих в состав гранулемы. После стимуляции IFN-gamma, экспрессия p21^Waf1 была индуцирована только у человеческих макрофагов, подтверждая наши предыдущие результаты, полученные у мышей [12]. Это наблюдение, вместе с фактом, что окрашивание Anti-CD14 и Anti-CD45 наблюдалось в компактной структуре внутри гранулемы, указывает, что макрофаги - воспалительные клетки внутри гранулемы, которые экспрессируют высокие уровни p21^Waf1.

Обсуждение

Макрофаги играют важную роль при иммунном ответе. Эти клетки транспортируются кровью к очагам воспаления, где они остаются до разрешения воспаления [27]. Обычно, воспаление разрешается при устранении из очага воспаления клеток, таких как нейтрофилы, активизированные лимфоциты или макрофаги, главным образом с помощью процесса апоптоза [5]. Однако, при активном воспалении, выживание макрофагов затруднено ввиду того, что воспаление создает сложные условия выживания, включая окислительный стресс и отсутствие факторов роста.

Хотя IFN-gamma в очагах воспаления может производиться естественными киллерами и активизированными Th1 лимфоцитами, макрофаги могут быть защищены от апоптоза с помощью других механизмов [12]. Недавно, был идентифицирован новый компонент, защищающий макрофаги от апоптоза, протеогликан декорин. Этот белок защищиает макрофаги от апоптоза [13], поэтому, внеклеточная среда в очагах воспаления (цитокины, белки внеклеточного матрикса) определяет продолжительность жизни клеток и, таким образом, продолжительность воспалительного ответа.

В саркоидных гранулемах наблюдается ослабление процесса апоптоза [28, 29], что при острых воспалительных процессах может затрагивать по крайней мере 80 % клеток [5, 27]. Кроме того, присутствие апоптоза при саркоидозе коррелирует со спонтанным разрешением воспаления [28, 29], а персистирование гранулем коррелирует с ослаблением процесса апоптоза. Это может объяснять, почему мы не обнаруживали различий в паттерне экспрессии проапоптических генов при остром и хроническом саркоидозе, поскольку в обоих случаях мы исследовали пациентов с активной болезнью.

Мы проанализировали гены семейства Bcl-2 и p53, которые участвуют в процессе апоптоза [20 21 22]. Мы не наблюдали различий в экспрессии этих генов. Наши результаты не согласуются с предыдущими сообщениями, которые показали увеличение экспрессии генов семейства Bcl-2 [11, 30] или p53 [9, 31] при саркоидозе. Это различие может быть связано с используемыми для анализа тканями. В этих исследованиях, экспрессия гена была проанализирована в ткани легкого или в ЖБАЛ, которые содержат альвеолярные макрофаги, которые отличаются от тканевых макрофагов, которые находятся в очагах воспаления в коже. В этих исследованиях, увеличение экспрессии p53 или Bcl-2 коррелировало с присутствием апоптоза и разрешением воспаления [9, 28]. Это явление не наблюдалось у наших пациентов, поэтому, эти две ситуации не могут быть сравнимы.

При саркоидозе, Th1 лимфоциты производят увеличенные уровни Th1 цитокинов [16, 17, 32]. Однако, только IFN-gamma играет критическую роль в развитии гранулем, что поддержано экспериментальными данными, полученными Gudmundsson и Hunninghake [33], которые показали, что у мышей с разрушенным геном IFN-gamma, невозможно стимулировать формирование гранулем.

Мы показали, что IFN-gamma блокирует клеточный цикл путем индукции p21^Waf1 [12]. Используя RT-PCR и иммуногистохимический анализ, мы показали, что экспрессия p21^Waf1 у пациентов с саркоидозом увеличена и что это увеличение коррелирует с уровнями IFN-gamma. Кроме того, мы показали, что увеличение экспрессии p21^Waf1 является локальным (внутри гранулемы), но не системным эффектом, поскольку лейкоциты периферической крови пациентов с саркоидозом не экспрессировали эту молекулу. В пораженной ткани (в нашем исследовании, кожа), среда Th1 цитокинов увеличивает экспрессию p21^Waf1 и, таким образом, выживание макрофагов в гранулеме.

Выживание клеток также регулируется адгезией к компонентам внеклеточного матрикса [34 35 36]. Мы обнаружили, что сцепление макрофагов с декорином, ингибирует апоптоз с участием p21^Waf1 [13]. Адгезия макрофагов с декорином также увеличивает их активность [37]. Так как декорин ингибирует фиброз [26], мы подозревали, что декорин также играет важную роль в формировании гранулемы. Однако, мы не обнаруживали увеличение частоты пациентов, которые экспрессировали декорин.

Другой компонент внеклеточного матрикса, фибронектин, был экспрессирован только у пациентов с саркоидозом его экспрессия коррелировала с экспрессией IFN-gamma и p21^Waf1. Однако, активация макрофагов IFN-gamma не увеличивает экспрессию фибронектина [13] и сцепление с этим белком не стимулирует экспрессию p21^Waf1 [13].

Фибронектин - важный компонент воспалительной реакции и может играть ключевую роль в формировании и персистировании гранулем. Фибронектин участвует в процессе миграции моноцитов периферической крови [34 35 36] и стимулирует их дифференцирование в тканевые макрофаги [38, 39]. Макрофаги секретируют фибронектин в очаге воспаления, который производит их ''прилипание'' к очагу воспаления [13, 39]. Этот процесс является необходимым для формирования плотной структуры гранулемы. Кроме того, фибронектин увеличивает активацию T-лимфоцитов [40, 41], которые увеличивают производство IFN-gamma. Увеличение производства IFN-gamma - ключевое событие в индукции p21^Waf1 [12] и ингибирование апоптоза [12, 13].

Таким образом, фибронектин, увеличение производства IFN-gamma и индукция p21^Waf1 могут быть главными событиями, ответственными за с увеличением времени жизни клеток, формирующих гранулему и, таким образом, за продолжительное воспаление, наблюдаемое при саркоидозе.