Иммунный парадокс саркоидоза и регулирующие Т-клетки

JEM, Volume 203, Number 2, 359-370

Иммунный парадокс саркоидоза и регулирующие Т-клетки

Makoto Miyara, Zahir Amoura, Christophe Parizot, Cecile Badoual, Karim Dorgham, Salim Trad, Marianne Kambouchner, Dominique Valeyre, Catherine Chapelon-Abric, Patrice Debre, Jean-Charles Piette and Guy Gorochov
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) U543, Immunologie A, Internal Medicine Department, AP-HP Hopital Pitie-Salpetriere, 75013 Paris, France, Universite Pierre et Marie Curie-Paris6, 75005 Paris, France, INSERM U255, Centre de Recherches Biomedicales des Cordeliers, 75006 Paris, France, Pneumology Department, AP-HP Hopital Avicenne, 93000 Bobigny, France

Реферат

Саркоидоз характеризуется обширным местным воспалением (формированием гранулем, секрецией цитокинов), связанным с кожной анергией (отсутствие ответа на антигены in vitro и in vivo). Мы предположили, что эта парадоксальная ситуация связана с нарушением баланса между эффекторными и регулирующими T-лимфоцитами (регулирующие T-клетки). Мы показали, что CD4+CD25^BRIGHTFOXP3⁺ клетки накапливаются на периферии саркоидных гранулем, в ЖБАЛ и периферической крови пациентов с активным саркоидозом. Эти клетки имеют мощную антипролиферативную активность, и все же полностью не ингибируют производство TNF-alpha. Поэтому, саркоидоз связан с глобальным увеличением субпопуляции регулирующих Т-клеток, чья активность недостаточна, чтобы контролировать местное воспаление. В то же самое время, на периферии, регулирующие T-клетки проявляют мощную антипролиферативную активность, которая может объяснять состояние кожной анергии. В целом, наши результаты продвигают концептуальное понимание путей иммунного регулирования, что позволит понять иммунный парадокс саркоидоза и прогнозировать глубокое клиническое воздействиена иммунитет с помощью манипуляции с регулирующими Т-клетками.

Введение

Саркоидоз характеризуется присутствием неказеозных гранулем в разнообразных органах, наиболее обычно в легком. CD4+ и CD8+ T лимфоциты (1), а также небольшое число B-лимфоцитов, формируют характерное кольцо на периферии гранулемы. Наиболее тесно связанные с гранулемой лимфоциты имеют фенотип Th1 (2). Th1 клетки секретируют цитокины IL-2 и IFN-gamma и играют важную роль в клеточном иммунном ответе. Механизмы, лежащие в основе формирования, персистирования и спонтанного разрешения гранулем саркоида изучены плохо (3, 4).

Саркоидоз является пока нерешенным иммунологическим парадоксом: вовлеченные органы - участок состредоточенного интенсивного иммунного ответа, но в то же самое время, у пациентов с саркоидозом наблюдается состояние анергии, что проявляется подавлением иммунного ответа на туберкулин (5).

Регулирующие клетки, которых известно по крайней мере два типа, способны к ингибированию разнообразных иммунопатологических явлений, управляя пролиферацией CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов in vivo (6, 7). Первый тип клеток регулирует иммунный ответ посредством секреции цитокинов и представлен Tr1 клетками, продуцирущими IL-10 (8, 9) и Th3 клетками, продуцирущими TGF-beta (10). Второй тип регулирующих T-клеток является иннатным (врожденным) (регулирующие T-клетки). Этот тип клеток является медиатором супрессии и характеризуются конститутивной экспрессией CD25 (6). Иннатные регулирующие T-клетки были описаны у людей (11-15), где они главным образом представлены субпопуляцией CD25^BRIGHT CD4+ клеток (16). Потенциальная роль регулирующих T-клеток в болезнях человека в настоящее время является целью интенсивных исследований (17). Предполагалось, что модуляция числа или функции регулирующих T-клеток может быть полезной при лечении аутоиммунных болезней и рака (18-20).

Мы обнаружили, что саркоидоз характеризуется экспансией иннатных регулирующих T-клеток и что эти клетки эффективно подавляют пролиферацию нативных Т-клеток, но неспособны полностью подавить секрецию TNF- alpha.

Пациенты

В исследование были привлечены 47 взрослых пациентов (25 женщин и 22 мужчины; средний возраст 43 года; диапазон 23-65 лет) которые имели клиническую картину, совместимую с саркоидозом (3). Пациенты были разделены на две группы: пациенты с активным, недавно диагностированным саркоидозом (n = 29) и пациенты с бездействующей болезнью (n = 18). Пациенты с активной болезнью изучались до начала любой терапии. У пациентов с бездействующей болезнью (n = 5) терапия не проводилась или проводилась поддерживающая терапия с низкой дозировкой стероидов (< 10 милиграмм в день; n = 13). В качестве здоровой группы контроля использовалась 55 здоровых доноров крови из Etablissement Francais du Sang (Hospital Pitie-Salpetriere), согласованных по полу и возрасту. Гранулематозная группа контроля состояла из 13 ВИЧ-отрицательных пациентов (3 женщины и 10 мужчин; средний возраст 39 лет; диапазон 19-61 лет) с недавно диагностированныс активным туберкулезом. Анализ ЖБАЛ был выполнен у 19 пациентов с активным саркоидозом и 24 индивидуумов группы контроля без саркоидоза: неспецифический интерстициальный пневмонит (n = 4), легочный туберкулез (n = 2), лимфома с легочным вовлечением (n = 2), увеит (n = 14) и легочные инфекции (n = 2). Протокол исследования был рассмотрен и одобрен комитетом по этике (Comite Consultatif de Protection des Personnes dans la Recherche Biomedicale of Pitie-Salpetriere Hospital).

Результаты

Определение регулирующих T-клеток

Сначала с помощью проточной цитометрии был определен процент CD4+ лимфоцитов, экспрессирующих CD25. Фактор транскрипции FoxP3, важный для развития и функции регулирующих T-клеток (21-23) пока является лучшим из доступных маркеров для идентификации регулирующих T-клеток. Используя ПЦР в реальном масштабе времени, мы подтвердили, что только CD4+CD25^BRIGHT клетки экспрессируют высокие уровни FoxP3 среди всех CD4+ T-клеток. Мы также использовали ПЦР для отдельных клеток, чтобы точно вычислить долю FoxP3+ клеток среди всех сортируемых клеток. Хотя очень мало CD4+CD25 клеток эксперссировали FoxP3 (0.7 %), мы определили, что в среднем 86.5 % сортируемых CD4+CD25^BRIGHT клеток были FoxP3+. Кроме того, CD4+CD25^BRIGHT T-клетки имеют другие типичные особенности регулирующих T-клеток, например внутриклеточную экспрессию CTLA-4 (24, 25) и поверхностную экспрессию CCR4 (19). Более важно, что эти клетки - единственная субпопуляция CD4+ клеток, которая производит сильное дозозависимое ингибирование пролиферации Т-клеток (16). Эти фенотипические и функциональные данные позволяют нам определить CD4+CD25^BRIGHT T-клетки, как регулирующие T-клетки.

Высокие уровни CD4+CD25^BRIGHT Т-клеток в крови и ЖБАЛ при активном саркоидозе

Мы сравнили процент CD25^BRIGHT клеток среди циркулирующих CD4+ T-клеток у пациентов с саркоидозом и в группе контроля. Наблюдалось существенное увеличение процента CD25^BRIGHT клеток у пациентов с активным саркоидозом по сравнению с группой контроля или пациентами с бездействующим саркоидозом (5.05±0.33 %, n = 29 против 1.32±0.39 %, n = 55, P < 0.0001; и 1.18±0.81 %, n = 18, P = 0.001, соответственно). Никаких существенных различий не наблюдалось между пациентами с бездействующим саркоидозом и группой контроля (P = 0.25). Мы обнаружили небольшое, но статистически значимое уменьшение среднего процента циркулирующих CD4+CD25^BRIGHT T-клеток у пациентов с активным туберкулезом по сравнению с здоровой группой контроля (0.89±0.41 %, n = 13, P = 0.0016). Наконец, увеличенное число CD4+CD25^BRIGHT T-клеток также наблюдалось в вовлеченных саркоидозом органах. Существенное увеличение среднего процента CD4+CD25^BRIGHT T-клеток в ЖБАЛ отмечено при активном саркоидозе по сравнению с болезнями, походящими на саркоидоз (7.01±3.96 %, n = 19, против 1.18±0.85 %, n = 24, P < 0.0001). В одном случае нам удалось извлечь лимфоциты из кожных саркоидных повреждений. 7.8 % CD4+ T-клеток в этом случае были CD25^BRIGHT.

CD4+CD25^BRIGHT T-клетки ЖБАЛ демонстрируют высокий уровень экспрессии CXCR3

В попытке идентифицировать потенциальный механизм, который объяснил бы, почему так много CD4+CD25^BRIGHT T-клеток найдено в легком, принимая во внимание, что другие клетки рециркулируют на периферию, мы изучали экспрессию рецепторов хемокинов у этих клеток. В группе контроля все CD4+CD25^BRIGHT T-клетки экспрессировали CCR4, но только их небольшая часть экспрессировала CXCR3. Однако, у пациентов с саркоидозом, все CD4+CD25^BRIGHT Т-клетки ЖБАЛ демонстрируют высокий уровень экспрессии CXCR3, принимая во внимание, клетки периферической крови демонстрируют низкий уровень экспрессии этого рецептора. Паттерн экспрессии других рецепторов хемокинов (CCR1 к CCR9, CXCR4, CXCR6 и CX3CR1) у CD4+CD25^BRIGHT T-клеток также изучался (26), но никаких явных различий между пациентами с саркоидозом и группой контроля не наблюдалось.

CD4+CD25^BRIGHTT-клетки пациентов с саркоидозом демонстрируют поликлональный репертуар ТКР

Чтобы выяснить, увеличено ли число CD4+CD25^BRIGHT T-клеток при активном саркоидозе в результате олигоклональной экспансии, мы исследовал репертуар ТКР CD4+CD25^BRIGHT T-клеток. По методике, описанной ранее (27, 28), мы изучали девять BV семейств, которые охватывают > 50 % репертуара ТКР у здоровых индивидуумов (29, 30). Мы использовали метод (31), основанный на анализе полиморфизма длины ТКР CDR3, чтобы оценить клональный состав субпопуляции CD4+CD25^BRIGHT T- клеток. 5 x 10⁵ этих клеток и соответствующее число CD4+CD25- T-клеток, были получены из ткани лимфатического узла одного пациента с активным саркоидозом. Было проверено, что CD4+CD25^BRIGHT T-клетки, используемые для анализа репертуара ТКР, действительно проявляют свойство иммуносупрессии. Анализ показал, что обе субпопуляции клеток имеют подобное распределение полиморфизма длины ТКР CDR3.

Уменьшение численности субпопуляции CD4+CD25^BRIGHT Т-клеток при разрешении саркоидоза

Поскольку мы наблюдали, что активный саркоидоз характеризуется увеличением численности субпопуляции CD4+CD25^BRIGHT Т-клеток, мы проверили, изменится ли численность субпопуляции CD4+CD25^BRIGHT Т-клеток у того же самого индивидуума при изменении активности болезни. У 11 пациентов, наблюдаемых в течение продолжительного времени, наблюдалось существенное уменьшение первоначально увеличенной численности субпопуляции CD4+CD25^BRIGHT Т-клеток, которая вернулась к нормальным уровням при разрешении болезни (5.2±4.7 % против 1.2±0.4 %, P = 0.02). Увеличение численности субпопуляции CD4+CD25^BRIGHT Т-клеток явно связано с прогрессом болезни.

CD4+ FoxP3+ клетки накапливаются на периферии неказеозных гранулем

Мы пытались визуализировать локализацию регулирующих T-клеток в вовлеченных органах, используя микроскопический анализ. Мы обнаружили, что CD4+ FoxP3+ клетки накапливаются на периферии гранулемы. Численность этих клеток была больше в вовлеченных саркоидозом лимфатических узлах, чем в нормальной лимфоидной ткани индивидуумов группы контроля (6.48±2.12 % CD4 + клетки, n = 10 против 1.67±0.67 %, n = 2).

CD4+CD25^BRIGHTT клетки пациентов с активным саркоидозом подавляют пролиферацию T- клеток

Фенотипических характеристик CD4+CD25^BRIGHT клеток, которые также являются CCR4+CTLA-4+, не достаточно, чтобы определить их как иммуносупрессивные регулирующие T-клетки. Поэтому мы проверили, является ли субпопуляция CD4+CD25^BRIGHT при активном саркоидозе функционально активной ex vivo. Как и ожидалось, CD4+CD25- T-клетки пациентов с саркоидозом имеют способность к подавлению пролиферации по сравнению со здоровой группой контроля (29,700±24,130 cpm, n = 18 против 62,300±20,200 cpm, n = 19, P = 0.0005). Независимо от происхождения (кровь, ЖБАЛ или ткань лимфатического узла), CD4+CD25^BRIGHT T-клетки пациентов с саркоидозом подавляют пролиферацию Т-клеток одинаково эффективно.

Регулирующие T-клетки при саркоидозе подавляют серецию IL-2, но не IFN- gamma или TNF-alpha аутогенными и аллогенными клетками

Известно, что TNF- alpha играет важную роль в физиопатологии саркоидоза (3, 4). Поэтому, мы исследовали влияние регулирующих T-клеток, изолированных у пациентов с саркоидозом на производство цитокинов. Культуры клеток 9 пациентов с саркоидозом и 9 индивидуумов группы контроля были проанализированы в течение 5 дней. В группе контроля, регулирующие T-клетки полностью ингибировали секрецию TNF- alpha и IFN-gamma через 5 дней после стимуляции (частичное ингибирование через 3 дня), принимая во внимание, что у пациентов с саркоидозом, через 5 дней наблюдалась остаточная секреция цитокинов. Интересно, что регулирующие Т-клетки пациентов с саркоидозом ингибируют производство IL-2 (остаточная секреция 4.21±2.57 %, n = 18 против 4.23±2.90 %, n=19, в группе контроля), но не IFN- gamma (19.02±12.37 % против 4.07±2.91 %) и TNF- alpha (27.23±15.29 % против 2.45±2.7 %). При этом, контрольные регулирующие T-клетки ингибируют секрецию всех трех цитокинов.

Затем мы пытались выяснить, могут ли регулирующие T-клетки непосредственно подавлять источник серкеции TNF-alpha у пациентов с саркоидозом. Мы обнаружили, что CD4+CD25^BRIGHT клетки вносят лишь небольшой вклад в остаточный уровень секреции TNF-alpha, наблюдаемой у пациентов с саркоидозом через 5 дней после стимуляции. Дальнейшие эксперименты показали, что раннее производство (через 1 день) TNF- alpha производится акцессорными клетками (ACs), принимая во внимание, в дальнейшем, большая часть TNF- alpha, производится CD25- T-клетками. Только последний источник TNF- alpha чувствителен к подавлению регулирующими Т-клетками.

Затем мы исследовали предположение, что частичная потеря регулирующей функции в отношении секреции цитокинов является результатом уменьшения активности регулирующих Т-клеток или увеличения резистентности CD4+CD25- клеток к ингибированию секреции. Для этого, регулирующие T-клетки пациентов с саркоидозом были проверены на клетках здоровых доноров, и наоборот. Регулирующие T-клетки пациентов не полностью блокируют секрецию цитокинов клетками пациентов или здоровой группы контроля. Однако, остаточное количество TNF- alpha было обнаружено в супернатанте CD4+CD25- клеток пациентов с саркоидозом, стимулированных в присутствии регулирующих T-клеток группы контроля.

Вышеупомянутые результаты были получены с использованием анти-CD3 (16) и аллогенных ACs в качестве стимулятора (12-14, 32, 33). Чтобы проверить, что сохранение секреции TNF-alpha и IFN-gamma не было вторичным к сильному аллогенному ответу, мы повторили функциональные исследования регулирующих T-клеток, используя только аутогенные ACs и анти-CD3 (0.5 µg/ml). При этих условиях, производство TNF-alpha и IFN-gamma полностью не подавлялись регулирующими Т-клетками пациентов с саркоидозом (n = 4) по сравнению с группой конторля (n = 5, P < 0.02). Поэтому, неполное подавление секреции TNF-alpha и IFN-gamma наблюдается не только в контексте сильного аллогенного ответа.

Большинство клеток, секретирующих IFN- gamma /TNF-alpha не производит IL-2

Из наших результатов следует, что регулирующие Т-клетки по-разному влияют на производство TNF-alpha, IFN-gamma и IL-2. Мы предположили, что частично это можно объяснять тем, что TNF-alpha и IFN-gamma не производятся клетками, которые производят IL-2. Мы использовали четырехцветную проточную цитометрию, чтобы контролировать IL-2, TNF-alpha и IFN- gamma у трех пациентов с саркоидозом и пяти индивидуумов группы контроля после кратковременного возбуждении in vitro. Мы показали, что производство IFN- gamma и IL-2 взаимно исключают друг друга. Хотя некоторая часть CD4+ клеток, производящих TNF-alpha, может производить IL-2, субпопуляция CD4+ IL2- TNF-alpha+ IFN-gamma+ клеток может быть обнаружена у пациентов с саркоидозом и в группе контроля.

Обсуждение

Общепринято, что саркоидоз - болезнь обусловленная чрезмерной местной активностью лимфоцитов Т-хелпер (1). Однако, при этом трудно объяснить, почему интенсивная воспалительная активность, наблюдаемая у пациентов с саркоидозом обычно сопровождается состоянием анергии. Первоначально было предположено, в развитии этого состояния участвуют супрессорные CD8+ T-клетки (1). Ранее, сообщалось о высоком проценте CD4+CD25^BRIGHT Т-клеток в крови и ЖБАЛ у HLA-DR17+ пациентов с активной болезнью (34), но регулирующая роль этих клеток не было продемонстрирована.

Мы показали, что численность субпопуляции регулирующих Т-клеток действительно увеличена в периферической крови и ЖБАЛ у пациентов с активным саркоидозом. Способность этих клеток in vitro ингибировать пролиферацию CD4+CD25- T-клеток и секрецию IL-2, контрастирует с их неспособностью полностью ингибировать секрецию TNF- alpha (и в меньшей степени IFN- gamma). Последнее наблюдение особенно интересно, поскольку TNF-alpha играет ключевую роль в формировании гранулемы (35) и что антитела к TNF-alpha доказали свою эффективность при лечении рефрактерного саркоидоза (36). Поскольку регулирующие T-клетки полностью не блокируют секрецию TNF-alpha, они могут лишь частично участвовать в развитии гранулемы in vivo. Об ограниченном эффекте регулирующих T-клеток на секрецию TNF-alpha ранее сообщалость у пациентов с ревматоидным артритом (37). Функция регулирующих Т-клеток нарушена при рассеянном склерозе (38). Учитывая наши данные, мы не можем окончательно утверждать, что регулирующие T-клетки у пациентов с саркоидозом имеют специфический дефект. Одинаково вероятно, что эти клетки просто неспособны полностью контролировать чрезмерную секрецию TNF-alpha. Наш анализ производства цитокинов на клеточном уровне позволяет выделить несколько субпопуляций CD4+ клеток согласно профилю секреции цитокинов. В частности, может быть выделена субпопуляция CD4+IL2- IFN-gamma+ TNF-alpha+ клеток. Для определения чувствительности других субпопуляций к функциональным действиям регулирующих Т-клеток у пациентов с саркоидозом необходимы дополнительные исследования. В любом случае, возможно, что у фенотипически и функционально различных субпопуляций CD4+ клеток эффект регулирующих T-клеток является различным.

Хотя регулирующие Т-клетки неспособны к полному подавлению секреции TNF-alpha и IFN-gamma у пациентов с саркоидозом, они проявляют сильную антипролиферативную активность и способны ингибировать секрецию IL-2 в среднем на 95.8±2.6 %. Экспансия T-клеток является критически важным аспектом при ответе на антеген. T-лимфоцитов памяти, специфических для данного антигена недостаточно. Пролиферация последних может быть эффективно подавлена регулирующими Т-клетками, особенно в лимфоидных органах, где обнаружено большое число регулирующих Т-клеток. Мы показали, что регулирующие T-клетки могут быть найдены в больших количествах в лимфатических узлах пациентов с саркоидозом, но редко обнаруживаются в лимфатических узлах здоровой группы контроля, что поддерживает гипотезу нарушения баланса между T-клетками памяти и регулирующими Т-клетками как возможного механизма анергии.

Поэтому мы считаем, что вышеупомянутый парадокс может быть объяснен, если предположить, что регулирующие T-клетки сильно регулируют гомеостаз Т-клеток, главным образом посредством контроля экспансии T-клеток (39), и что этот механизм является чрезмерно эффективным у пациентов с саркоидозом. Возможно, этот же самый механизм не позволяет контролировать воспаление в поврежденных тканях.

У пациентов с активным саркоидозом, у CD4+CD25^BRIGHT T-клеток, независимо от ткани происхождения, экспрессирован рецептор хемокина CCR4. Напротив, CXCR3 экспрессирован у CD4+CD25^BRIGHT Т-клеток ЖБАЛ. Недавно было показано, что специфическая миграция регулирующих T-клеток в опухоли яичника человека определяется секрецией лиганда CCR4 CCL22 (макрофагальный хемокин) клетками опухоли и макрофагами микроокружающей среды (19). Однако, легочные макрофаги пациентов с саркоидозом не секретируют CCL22 (40), принимая во внимание, что они, как известно, производят высокие уровни лиганда CXCR3 CXCL10 (IP-10) (41). Поэтому возможно, что именно в ответ на секрецию IP-10 активизированными тканевыми макрофагами привлекаются CXCR3+ регулирующие T-клетки. Только CXCR3- клетки могут рециркулировать на периферию.

Чтобы исследовать другой потенциальный механизм, который мог бы стимулировать миграцию регулирующих Т-клеток, мы изучили репертуар ТКР этой субпопуляции. Используя анализ полиморфизма длины CDR3 (27), мы обнаружили, что CD4+CD25^BRIGHT регулирующие T-клетки поликлональны у одного пациента с саркоидозом. Поэтому маловероятно, что у этого пациента экспансия CD4+CD25^BRIGHT Т-клеток была следствием прямого антигенного возбуждения. К сожалению, до настоящего времени не было возможным достаточно хорошо очистить CD4+CD25^BRIGHT Т-клетки из саркоидного ЖБАЛ, поэтому выполнить надежные исследования репертуара ТКР не было возможным. Известно что олигоклональная субпопуляция beta+ alpha+ CD4+ T-клеток может быть обнаружена на участках гранулематозного воспаления (42-44) и на участках реакции Квейма (45). Микобактериальная каталаза-перокидаза была недавно идентифицирована как одна из целей адаптивного иммунного ответа при саркоидозе (46), но остается неизвестным, есть ли фактически в составе саркодных гранулем микобактериальная каталаза-перокидаза-специфические Т-клетки. В свете полученных нами данных, интересно изучить реактивность саркоидных регулирующих T-клеток к микобактериальным антигенам.

По нашим данным, не существует клинической ситуации, при которой увеличение численности регулирующих Т-клеток достигает такой большой величины (до 21 % от численности CD4+ T-клеток) в крови пациентов. Возможно, что наблюдаемое спонтанное производство IL-2 T-лимфоцитами при активном легочном саркоидозе может быть одним из факторов, которые способствует этому (47). Об увеличении циркуляции CD4+CD25^BRIGHT Т-клеток сообщалось при хронической реакции ''трансплантант против хозяина'' (48), но это увеличение никогда не превышено 11 %. Накопление регулирующих T-клеток также наблюдается в суставах при ревматоидном артрите (49) и в лимфатических узлах при болезни Ходжкина (50). В настоящее время не существует ''золотого стандарта'' для подтверждения диагноза саркоидоз. В стадии реализации находится несколько исследований, которые выясняют, является ли экспансия регулирующих T-клеток достаточно специфическим маркером, который позволит отличить саркоидоз от других гранулематозов.

Наконец, предполагалось, что модуляция числа или функции регулирующих T-клеток может быть полезной при лечении аутоиммунных болезней и других иммунопатологических состояний (7, 18). Наши данные поддерживают это предполопжение, но также указывают на потенциальную опасность подобной терапии. Действительно, пациенты с саркоидозом предрасположены к оппортунистическим инфекциям (51). Предполагалась, что это может быть связано с хроническим воспалением и последующим повреждением ткани в вовлеченных органах (52). В свете полученных данных, мы предполагаем, что нарушение баланса между Th1 клетками и регулирующими Т-клетками может объяснить такую предрасположенность.