Chest. 2006;129:1592-1598.

Уменьшение экспрессии перфорина и активация молекул адгезии при легочном саркоидозе

Katerina M. Antoniou, MD, PhD; Ioanna Tsiligianni, MD, PhD; Despina Kyriakou, MD, PhD; Nikolaos Tzanakis, MD, PhD; Argyris Tzouvelekis, MD; Nikolaos M. Siafakas, PhD, FRCP, FCCP and Demosthenes Bouros, PhD, FCCP
From the Department of Pneumonology, University of Crete, Heraklion, Greece; the Department of Hematology, University of Thessaly, Larissa, Greece; the Interstitial Lung Disease Unit, Imperial College, Faculty of Medicine, London, UK; and the Department of Pneumonology, Democritus University of Thrace, Alexandroupolis, Greece.

Реферат

Введение: индукция мокроты была предложена в качестве полезного атравматичного метода для оценки болезней дыхательных путей. Однако, изменен ли при саркоидозе баланс цитотоксических Tc1 и Tc2 клеток, неизвестно.

Цель: цель исследования состояла в том, чтобы охарактеризовать субпопуляции CD8+ T-лимфоцитов в индуцированной мокроте у пациентов с саркоидозом и сравнивать их с субпопуляциями CD8+ T-лимфоцитов в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом. Для исследования механизма цитотоксической активности CD8+ лимфоцитов, мы измерили экспрессию перфорина. Дополнительно были исследованы две молекулы адгезии (CD62 и CD71), которые экспрессированы на CD8+ T-клетках и могут служить новыми иммунологическими маркерами.

Место проведения: Department of Thoracic Medicine, University of Crete и Department of Pneumonology, Democritus University of Thrace, Alexandroupolis, Greece.

Пациенты: мы проспективно изучили данные 22 пациентов с саркоидозом (средний возраст 48 лет; диапазон от 25 до 65 лет) и 10 здоровых индивидуумов (5 женщин и 5 мужчин; средний возраст 39 лет; диапазон от 26 до 60 лет).

Измерения: после стимуляции лимфоцитов форболмиристатацетатом, с помощью иммуноцитометрии идентифицировались CD8+ клетки, производящие IFN-gamma (то есть Tc1) и CD8+ клетки, производящие IL-4 (то есть, Tc2).

Результаты: мы обнаружили существенное уменьшение процента IFN-gamma+ CD8+ T-клеток в ЖБАЛ (p = 0.001) и индуцированной мокроте (p = 0.001) у пациентов с саркоидозом по сравнению с групой контроля до стимуляции форболмиристатацетатом. Однако, существенных различий между числом лимфоцитов после стимуляции форболмиристатацетатом обнаружено не было. Уменьшенная экспрессия перфорина была обнаружена в ЖБАЛ (p = 0.001) и индуцированной мокроте (p < 0.001) у пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля. Активность молекул адгезии была значительно увеличена в ЖБАЛ и индуцированной мокроте у пациентов с саркоидом по сравнению с группой контроля.

Заключение: наши результаты говорят, что активность воспаления может быть определена, используя индукцию мокроты у пациентов с саркоидозом. Кроме того, мы получили свидетельства, предполагающее, что CD8+ лимфоциты не могут играть главную роль при саркоидозе.

Введение

Саркоидоз - хроническая, системная болезнь неизвестной этиологии, которая характеризуется формированием неказеозных гранулем в вовлеченных органах, наиболее обычно в легких. Согласно рекомендаций ATS/ERS/WASOG (1), диагноз основан на клинических, радиологических и гистологических результатах. Признак легочного саркоидоза, мононуклеарный альвеолит, характеризуется активизацией CD4+ лимфоцитов памяти (2). Считается, что нарушение баланса экспрессии Th1 и Th2 цитокинов, играет важную роль в иммунопатотгенезе саркоидоза (1-3). Ранее был исследован баланс Th1/Th2 цитокинов в ЖБАЛ и периферической крови пациентов с саркоидозом (4-8). Наша группа недавно продемонстрировала преобладание Th1 ответа в индуцированной мокроте. Кроме того, мы обнаружили положительную корреляцию между CD4+ IFN-gamma+ клетками в индуцированной мокроте и ЖБАЛ в той же самой группе пациентов (9).

На основании профиля секретируемых цитокинов, CD8+ T-клетки (Tc клетки) классифицируются на два типа, Tc1 и Tc2 клетки (10,11). Tc1 клетки производят цитокины типа 1, принимая во внимание, что Tc2 клетки секретируют цитокины типа 2. Таким образом, поляризация отношения Tc1/Tc2, также как и нарушение баланса Th1/Th2, является детерминантом иммунного ответа при некоторых патологических состояниях. Все большее количество данных говорит, что изменение баланса Tc1/Tc2 может участвовать в патогенезе различных болезней (12,13). Возможно, изменение отношение Tc1/Tc2 может учствовать в патогенезе саркоидоза. Первое исследование, изучившее CD8+ T-лимфоциты при саркоидозе, было выполнено Baumer с коллегами (7). Они сообщили, что клоны CD8+ T клеток, которые были получены из паренхимы легкого пациентов с саркоидозом, не демонстрировали преобладание профиля цитокинов типа 1 или типа 2, принимая во внимание, что профиль цитокинов клонов CD4+ T-клеток, был смещен к типу 1 (7). Другое исследование показало, что баланс Tc1/Tc2 в ЖБАЛ и периферической крови пациентов с саркоидозом не был изменен (4). Хотя исследования не обнаружили нарушения баланса Tc1/Tc2 в ткани или ЖБАЛ у пациентов с саркоидозом (4,7), мы исследовали цитотоксичность CD8+ Т-клеток в индуцированной мокроте и различные иммунологические маркеры.

Чтобы полнее исследовать механизм цитотоксической активности CD8+ лимфоцитов, мы также измерили экспрессию перфорина в индуцированной мокроте и ЖБАЛ. Ранее сообщалось об опосредованной перфорином цитотоксичности (14,15), которая участвует в развитии различных болезней. Роль перфорина ранее не была исследована у пациентов с легочным саркоидозом. Сообщалось, что индуцированный перфорином апоптоз, может быть связан с патофизиологией повреждения легкого и фиброза (16). Кроме того, наша группа сообщила, что CD8+ лимфоциты у пациентов с ХОБЛ, имеют увеличенную экспрессию внутриклеточного перфорина по сравнению с курящими без ХОБЛ и здоровыми некурящими индивидуумами (17).

Основные механизмы накопления лимфоцитов в легком полностью не изучены. Вероятно, что в этом процессе участвуют множество молекул адгезии, например, селектины (L-селектин, CD62, который является молекулой адгезии лимфоцитов и рецептор трансферина CD71, который является маркером моноцитов / макрофагов), интегрины и суперсемейство Ig (18,19,20). Мы исследовали экспрессию вышеупомянутых маркеров CD8+ T-клеток в ЖБАЛ и индуцированной мокроте. L-селектин, член семейства селектинов, является гликозилированным белком, массой от 95 до 105 kd на нейтрофилах и 74 kd на лимфоцитах и экспрессирован на большинстве лейкоцитов (18). Сообщалось, что более высокие концентрации L-селектина присутствуют в сыворотке и ЖБАЛ пациентов с саркоидозом по сравнению с пациентами с идиопатическим легочным фиброзом (IPF) и здоровыми индивидууами (19,20). Однако, при ранней болезни наблюдается мононуклеарный альвеолит, с доминированием T-клеток и макрофагов. Чтобы объяснить увеличенную способность альвеолярных макрофагов по презентации антигена при саркоидозе, была исследована экспрессия рецептора трансферина (то есть, CD71). Значительные изменения фенотипа альвеолярных макрофагов были найдены у пациентов с активным саркоидозом, у которых наблюдается лимфоцитарный альвеолит с экспрессией CD54, KiM2, CD71, CD11b и RFD9 (21). Также мы исследовали фенотип T- клеток (то есть, CD62) параллельно с фенотипическими характеристиками моноцитов / макрофагов (то есть, CD71) у CD8+ клеток в ЖБАЛ и индуцированной мокроте.

Роль индуцированной мокроты была исследована у пациентов с саркоидозом, ХОБЛ и IPF (22,23,24). Ранее мы показали, что воспаление при саркоидозе может быть эффективно и атравматично исследовано при анализе дифференциальных индексов T-лимфоцитов в индуцированной мокроте (22). Недавно был продемонстрирован Th1-подобный паттерн секреции цитокинов CD4+ T-лимфоцитами в ЖБАЛ и индуцированной мокроте у пациентов с саркоидозом (9).

Главной целью нашего исследования было сравнение численности субпопуляции CD8+ T-лимфоцитов в ЖБАЛ и индуцированной мокроте у пациентов с легочным саркоидозом. Используя иммуноцитохимический анализ и проточную цитометрию, мы исследовали производство внутриклеточных цитокинов, IFN-gamma и IL-4 и экспрессию маркера цитотоксичности T-клеток, перфорина, у CD8+ T-клеток. Для улучшения понимания патогенетических механизмов гранулематозного воспаления при саркоидозе, мы измерили уровни молекул адгезии в ЖБАЛ и индуцированной мокроте (то есть, CD62 и CD71) у CD8+ T-клеток, которые, как предполагается, служат важными медиаторами взаимодействия между T-клетками и макрофагами.

Пациенты

В исследование были включены 22 пациента с саркоидозом, 10 мужчин и 12 женщин (средний возраст 48 лет; диапазон от 25 до 68 лет). Два пациента курили, остальные 20 пациентов не курилии. Диагноз был установлен на основании критериев ATS/ERS/WASOG (1). У всех пациентов была проведена трансбронхиальная или открытая биопсия легкого, которая показала неказеозные эпителиоидноклеточные гранулемы. Девять пациентов имели стадию I болезни, 7 пациентов имели стадию II и 6 пациентов имели стадию III болезни.

Группа контроля включала 10 здоровых некурящих добровольцев (5 женщин и 5 мужчин; средний возраст 39 лет; диапазон от 26 до 60 лет) которые были способны произвести адекватное количество мокроты после индукции. Из исследования были исключены пациенты и члены группы контроля, которые имели острую респираторную инфекцию в течение 6 недель до начала исследования. Комитет по этике одобрил протокол исследования и все участники дали информированное согласие.

Результаты

Средний процент CD8+ T-клеток, производящих IFN-gamma в ЖБАЛ, был значительно ниже у пациентов с саркоидозом, чем в группе контроля (11.8 ± 6.7 % против 23.7 ± 2.3 %, соответственно) до стимуляции форболмиристатацетатом / иономицином. Аналогично, в индуцированной мокроте, средний процент CD8+ T-клеток, производящих IFN-gamma, был значительно ниже у пациентов с саркоидозом чем в группе контроля (6.0 ± 2.6 % против 13.4 ± 5.6 %, соответственно; p = 0.001) до стимуляции форболмиристатацетатом / иономицином.

Напротив, никаких различий не было найдено по среднему проценту производящих IL-4 CD8+ T-клеток между пациентами с саркоидозом и группой контроля в ЖБАЛ (0.92 ± 0.76 против 0.47 ± 0.26, соответственно; p = 0.129) и в индуцированной мокроте (0.26 ± 0.22 против 0.5 ± 0.41, соответственно; p = 0.077). После стимуляции форболмиристатацетатом / иономицином, не было обнаружено существенного различия процента CD8+ T-клеток (Tc1 или Tc2) производящих цитокины в ЖБАЛ (p = 0.21 и p = 0.12, соответственно) и индуцированной мокроте (Tc1, p = 0.09; Tc2, p = 0.07) между пациентами с саркоидозом и группой контроля.

Экспрессия перфорина у CD8+ клеток

Средний процент CD8+ T-клеток, экспрессирующих перфорин, был значительно ниже у пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля, в ЖБАЛ (49.77 ± 10.44 % и 65.90 ± 11.68 %, соответственно; p = 0.001) и индуцированной мокроте (41.68 ± 8.94 % и 60.20 ± 6.07 %, соответственно; p < 0.001).

Экспрессия L-селектина и лиганда CD71

После стимуляции форболмиристатацетатом и иономицином, CD8+ T-клетки ЖБАЛ и индуцированной мокроты были исследованы на маркеры активации, L-селектин (CD62) и рецепторы трансферина (CD71). Уровни маркеров активации у пациентов с саркоидозом были значительно увеличены и в ЖБАЛ и в индуцированной мокроте по сравнению с группой контроля. Однако, мы не обнаружили существенной корреляции между концентрациями CD62 и CD71 в ЖБАЛ и индуцированной мокротое и уровнями АПФ, маркером активности болезни.

Обсуждение

По нашим данным, это первое исследование роли CD8+ лимфоцитов и их подтипов, Tc1 и Tc2, в индуцированной мокроте у пациентов с легочным саркоидозом. Мы обнаружили уменьшение экспрессии перфорина в двух различных биологических жидкостях, принимая во внимание, что уровни молекул адгезии были значительно увеличены у пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля.

Мы показали, что Tc1-подбный паттерн секреции цитокинов был значительно уменьшен у пациентов с саркоидозом в ЖБАЛ и индуцированной мокроте до стимуляции форболмиристатацетатом / иономицином по сравнению группой контроля. Inui с коллегами (4) также обнаружили небольшой процент производящих цитокины клеток, число которых в ЖБАЛ существенно не различалось между пациентами с саркоидозом и здоровой группой контроля.

Затем мы стимулировали лимфоциты форболмиристатацетатом и иономицином, чтобы получить точную информацию относительно иммунного статуса пациентов с саркоидозом. Форболмиристатацетат - мощный стимулятор CD8+ клеток, который увеличивает их способность экспрессировать IL-4 или IFN- gamma (32). Таким образом, это позволяет обнаружить различия в регулировании секреции цитокинов, которые не обнаружимы иным способом (4,31,33). При возбуждении форболмиристатацетатом / иономицином, никаких различий не было найдено в проценте производящих цитокины CD8+ T клеток (Tc1 и Tc2) в индуцированной мокроте и ЖБАЛ, между пациентами и группой контроля. Результаты предыдущих исследований паренхимы легкого (7), ЖБАЛ и периферической крови (4), показали, что баланс Tc1/Tc2 не был изменен у пациентов с легочным саркоидозом, что согласуется с нашими результатами. По нашим данным, в нашем исследовании эти параметры были впервые оценены в индуцированной мокроте. Наши результаты говорят, что Tc1 клетки не могут играть главную роль при саркоидозе.

Кроме того, мы исследовали цитотоксичность CD8+ T лимфоцитов, отражаемую профилем экспрессии перфорина. Ранее мы показали, что у пациентов с ХОБЛ, что экспрессия перфорина у CD8+ клеток была значительно выше у курящих пациентов с ХОБЛ, чем у курящих без ХОБЛ (p = 0.01) и здоровых некурящих индивидуумов (p = 0.001) (17), что указывает, что курение сигарет может увеличивать активность перфорина. С другой стороны, существует отрицательная связь между курением сигарет и саркоидозом (33,34). Чтобы объяснить возможный защитный эффект курения по отношению к развитию саркоидоза, необходимы исследования экспрессии перфорина у курящих пациентов с легочным саркоидозом. К сожалению, это не было возможным в нашем исследовании, поскольку наша группа пациентов с саркоидозом включала только двух курильщиков.

Кроме того, было показано (16), что регулируемый перфорином апоптоз может быть связан с патофизиологией повреждения легкого и фиброза. Дифференциальная экспрессия перфорина у пациентов с саркоидозом и IPF может частично объяснять различия патогенеза, прогноза и клинического курса двух вышеупомянутых болезней. Дальнейшие исследования необходимы, чтобы объяснить роль маркеров цитотоксичности T-клеток в каскаде иммунологических событий при саркоидозе и определить, являются ли эти маркеры специфическими для саркоидоза или также связаны с другими интерстициальными болезнями легкого.

Было предположено, что гранулематозное воспаление при саркоидозе происходит в результате скоординированного взаимодействия между T-клетками и макрофагами (35). Было предположено, что некоторые медиаторы адгезии клетка-клетка и клетка-матрикс, включая селектины, интегрины и члены семейства Ig, участвуют в развитии лимфоцитарного альвеолита у пациентов с саркоидозом (19,20,36). Ishii и Kitamura (36) сообщили об увеличенных уровнях растворимых молекул адгезии в сыворотке и ЖБАЛ у пациентов с саркоидозом. Эти данные были подтверждены двумя другими исследованиями (19,20). Кроме того, лимфоцитарный альвеолит у пациентов с активным саркоидозом, связан с существенными изменениями фенотипа альвеолярных макрофагов и более частой экспрессии CD71 и других молекул (21,37,38). Однако, основные механизмы накопления лимфоцитов в легком и формирования неказеозных гранулем все еще дискутируются и заслуживают дальнейших исследований.

Для того, чтобы получить целостное представление о местной экспрессии поверхностных молекул, мы исследовали активацию молекул адгезии лимфоцитов (L-селектин CD62) и маркера моноцитов / макрофагов (рецептор трансферина CD71) в ЖБАЛ и мокроте пациентов с саркоидозом. Мы обнаружили увеличенные уровни обоих маркеров в ЖБАЛ и индуцированной мокроте, таким образом подтверждая предыдущие результаты. Тем не менее, наше исследование не обнаружило существенной связи уровней L-селектина и CD71 с клиническими и лабораторными параметрами активности саркоидозоа, включая уровни АПФ. Однако, это не уменьшает ценность наших данных, так как они согласуются с более ранними исследованиями (19,20) и число параметров, по которым оценивается активность саркоидоза, ограничено (39). Будущие исследования должны выяснить, являются ли местные уровни молекул адгезии критически важным аспектом воспалительной активности и отражают ли они серьезность болезни.

Мы показали, что исследование индуцированной мокроты является многообещающим методом при оценке интерстициальных болезней легкого, но ее диагностическая ценность пока не известна. Учитывая данные нашего и других исследований (9,22), мы считаем, что воспаление у пациентов с саркоидозом может быть эффективно и атравматично исследовано, используя индукцию мокроты.

Наши результаты говорят, что при легочным саркоидозе баланс Tc1/Tc2 клеток в индуцированной мокроте и ЖБАЛ не нарушен. Кроме того, мы показали, что при легочном саркоидозе, экспрессия перфорина уменьшена, а активность молекул адгезии увеличена, что указывает на участие этих маркеров в развитии лимфоцитарного альвеолита у пациентов с саркоидозом. Эти результаты улучшают понимание патогенеза саркоидоза и указывают на новые цели для терапии. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить эти результаты в различных стадиях активности болезни.