American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine Vol 173. pp. 1145-1154, (2006)

Белковый профиль ЖБАЛ пациентов с легочным саркоидозом

Eva Kriegova, Christian Melle, Vitezslav Kolek, Beata Hutyrova, Frantisek Mrazek, Annett Bleul, Roland M. du Bois, Ferdinand von Eggeling and Martin Petrek
Faculty of Medicine, Palacky University, Olomouc, Czech Republic; Core Unit Chip Aбелковый паттернlication, Institute of Human Genetics and Anthropology, Friedrich Schiller University, Jena, Germany; and Royal Brompton Hospital, London, United Kingdom

Реферат

Введение: легочный саркоидоз - мультисистемная гранулематозная болезнь с различными клиническими фенотипами. Информации относительно белкового паттерна жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) у пациентов с саркоидозом мало и практически нет данных о белкововом паттерне ЖБАЛ при различных клинических подтипах болезни.

Цель: исследовать белковый паттерн ЖБАЛ пациентов с легочным саркоидозом и оценить, отражает ли белковый паттерн курс рентгенографической болезни и сравнить белковый паттерн между пациентами с и без синдромом Лёфгрена.

Методы: десорбционная ионизационная лазерная времяпролетная масс-спектрометрия использовалась, чтобы исследовать белковый паттерн в несконцентрированном ЖБАЛ у 65 пациентов с легочным саркоидозом (стадия I, n = 32; II стадия, n = 22, стадия III, n = 11) и у 23 здоровых индивидумов в группе контроля. Тест Манна-Уитни использовался, чтобы обнаружить различия экспрессии белковых пиков. После фракционирования, метод фингерпринтов (генетических ''отпечатков пальцев'') и иммунодеплеция использовались, чтобы идентифицировать изменение (ослабление или усиление) экспрессии белков.

Результаты: у пациентов с легочным саркоидозом по сравнению с группой контроля были обнаружены 40 дифференциально экспрессированных белковых объектов (2.75-185.62 kD) (p < 0.05). Принимая во внимание, что 13 пиков (33 %) наблюдались во всех рентгенографических стадиях, 27 пиков (67 %), были специфическими для различных рентгенографических стадий. Сравнение белкового паттерна между пациентами со стадией I с или без синдрома Лёфгрена, показало 25 дифференциально экспрессированных пиков. Общее количество белковых пиков, а также количество белковых пиков, связанных с саркоидозом, в целом были заметно ниже у пациентов с синдромом Лёфгрена по сравнению с другими фенотипами саркоида. Человеческий серологический альбумин, альфа1 антитрипсин и предшественник протокадгерина-2 были идентифицированы в белковом паттерне ЖБАЛ при саркоидозе.

Заключение: десорбционная ионизационная лазерная времяпролетная масс-спектрометрия позволяет определить белковый паттерн ЖБАЛ при саркоидозе и позволяет идентифицировать белковый паттерн, связанный со специфическим курсом болезни.

Введение

Саркоидоз - воспалительная болезнь, характеризованная накоплением CD4+ Th1 лимфоцитов и макрофагов с последующим формированием гранулемы на участке активности болезни, особенно в легком (1, 2). Эта мультисистемная болезнь неизвестной этиологии в Чешской Республике имеет распространенность 63.1 на 100,000 (3). Спонтанная ремиссия или стабилизации болезни происходит приблизительно в двух третях случаев, но у ~20 % пациентов развивается хроническая болезнь и прогресс к фиброзу (4). Современные исследования иммунобиологических механизмов саркоидоза в основном основаны на исследовании экспрессии мРНК (5, 6). Однако, эти данные должны быть дополнены исследованием белковой экспрессии (7-10). Исследования белкового профиля при саркоидозе могут позволить получить данные о экспрессии, модификации, взаимодействиях и регулировании белков при этой болезни.

Протеомный анализ ЖБАЛ при саркоидозе ранее проводился только с помощью двумерного (2D) электрофореза в геле с масс-спектрометрией (11-16). Белки, идентифицированные в ЖБАЛ, использовались для создания двумерной карты ЖБАЛ (BALF-2D-MAP) (15). В ЖБАЛ пациентов с саркоидозом, были идентифицированы несколько белков, участвующих в окислительных и противовоспалительных процессах а также в регулировании пролиферации (12, 13) параллельно с увеличением уровней плазменных белков (11, 13, 14). Некоторые из обнаруженных белков, например, белок клеток Клара-16 (13), соответствовали ранее полученным результатам (17). Однако, некоторые белки, присутствие которых ожидалось, учитывая результаты экспрессии мРНК, не были обнаружены. Это относится, например, к хемотаксическим цитокинам, экспрессия которых при саркоидозе увеличена и мРНК которых была обнаружена с помощью ELISA (18-24). Другие белки, которые не были обнаружены в ЖБАЛ при саркоидозе, являются цитокинами и их рецепторами, молекулами адгезии, также не были обнаружены белки, участвующие в регулировании воспалительных процессов (25).

Чтобы расширить знания о белковом профиле ЖБАЛ при саркоидозе, мы использовали новую технологию, десорбционную ионизационную лазерную времяпролетную масс-спектрометрию (SELDI-TOF MS) (26) у 65 пациентов с саркоидозом и 23 здоровых индивидумов в группе контроля. Также мы хотели определить, может ли этот метод, который ранее использовался для исследования рака (27-30), отражать развитие и прогресс болезни. Поэтому, мы сравнили белковый паттерн ЖБАЛ в рентгенографических стадиях I, II и III саркоидоза. Мы также исследовали, имеют ли пациенты с и без синдрома Лёфгрена, различный белковый паттерн ЖБАЛ. Мы использовали четыре различных типа белковых чипов с различными адсорбционными свойствами в отношении способности захватывать широкий спектр белков ЖБАЛ. Чтобы идентифицировать белки, связанные с саркоидозом, ЖБАЛ был фракционирован с помощью обратнофазовой жидкостной хроматографией и фракции, содержащие интересующие нас белки, были проанализированы с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE), метода фингерпринтов и иммунодеплеции.

Пациенты

ЖБАЛ была получена при выполнении фибробронхоскопии (33) у пациентов с легочным саркоидозом (n = 65) и здоровой группы контроля (n = 23). Диагноз легочного саркоидоза был установлен согласно критериев ATS/ERS/WASOG (4). Пациенты были разделены на рентгенографические стадии (стадия I, n = 32; стадия II, n = 22; стадия III, n = 11). Пациенты со стадией I были подразделены на две группы в зависимости от наличия синдрома Лёфгрена, с синдромом Лёфгрена (n = 14) и без синдрома Лёфгрена ( n = 18). Ни у одного пациента кортикостероидная терапия не проводилсь до получения ЖБАЛ. Группа контроля состояла из индивидуумов, которые не имели клинических признаков воспалительных болезней легкого в начале исследования и впоследствии, не имели никакой болезней легкого в медицинской истории и имели нормальную цитологию иммунологию и микробиологию ЖБАЛ. Исследование было одобрено комитетом по этике Palacky University, Olomouc, Czech Republic. Все участники исследования дали письменное информированное согласие на использование определенного количества ЖБАЛ, полученного в диагностических целях, для целей настоящего исследования.

Реультаты

Определение паттерна белковой экспрессии ЖБАЛ при саркоидозе

Чтобы исследовать, отличается ли паттерн белковой экспрессии ЖБАЛ у пациентов с саркоидозом и в группе контроля, несконцентрированный ЖБАЛ был проанализирован с помощью SELDI-TOF MS. В ЖБАЛ пациентов с саркоидзом, по сравнению с группой контроля, были обнаружены 40 дифференциально экспрессированных белковых объектов с отношением молекулярная масса / заряд (m/z) между 2.75 и 185.62 kD. Из этих 40 пиков, которые далее мы будем упоминать как ''связаные с саркоидозом'', экспрессия 26 белковых пиков (65 %) была значительно увеличена и экспрессия 14 белковых пиков (35 %) была уменьшена у пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля. Число белковых пиков с измененной экспрессией составляло приблизительно 10 % от всех белковых объектов. Большинство белковых объектов было обнаружено только на одном белковым чипе; 2 (5 %) были абсорбированы на двух различных белковых чипах.

Сравнение паттерна белковой экспрессии ЖБАЛ у пациентов с различными рентгенографическими стадиями саркоидоза

Чтобы исследовать различие белковой экспрессии в различных рентгенографических стадиях саркоидоза (I, II и III), пациенты были разделены на подгруппы согласно рентгенографической стадии. Полученные величины m/z и интенсивности сигнала для каждой рентгенографической стадии были сравнены с соответствующими данными группы контроля. Анализ показал что 13 из 40 связанных с саркоидозом белковых пиков (m/z: 4.53, 5.85, 11.91, 14.18, 15.35, 33.35, 44.43, 66.64, 89.77, 100.99, 122.98, 133.98 и 170.64 kD) имели существенно различную экспрессию во всех рентгенографических стадиях саркоидоза по сравнению с группой контроля.

В рентгенографической стадии I саркоидоза, были обнаружены 36 белковых пиков, имевших различную экспресиию по сравнению с группой контроля. Большинство из этих пиков (32, 80 %) были связаны с саркоидозом во всей группе. Экспрессия 3 дополнительных белковых пиков (m/z: 11.70, 39.29, и 59.62 kD) была выше и одного белкового пика выше (m/z: 97.34 kD) по сравнению с группой контроля.

В рентгенографической стадии II саркоидоза, был обнаружен 41 белковый пик, имевший различную экспрессию по сравнению с группой контроля. 29 пиков (71 %) были связаны с саркоидозом во всей группе. Экспрессия 11 дополнительных белковых пиков (m/z: 4.83, 6.42, 6.43, 6.65, 6.98, 8.22, 9.19, 11.35, 13.75, 44.70 и 196.31 kD) была выше и одного белкового пика ниже (m/z: 97.34 kD) по сравнению с группой контроля.

В рентгенографической стадии III саркоидоза, было обнаружено 33 белковых пика, имевших различную экспрессию по сравнению с группой контроля. 22 пика (67 %) были связаны с саркоидозом во всей группе. Экспрессия 11 дополнительных белковых пиков была специфической для стадии III. Экспрессия 8 дополнительных белковых пиков (m/z: 3.37, 3.43, 4.70, 7.85, 8.02, 8.21, 39.29 и 39.94 kD) была выше и трех пиков (m/z: 8.22, 10.84 и 22.12 kD) по сравнению с группой контроля.

Сравнение паттерна белковой экспрессии ЖБАЛ у пациентов со стадией I c и без синдрома Лёфгрена

Были обнаружены 37 белковых пиков, имевших различную экспресиию у пациентов без синдрома Лёфгрена по сравнению с группой контроля. Экспрессия 18 пиков (49 %) была значительно ниже у пациентов без синдрома Лёфгрена по сравнетию с группой контроля. 25 пиков (68 %) были связаны с саркоидозом во всей группе.

У пациентов с синдромом Лёфгрена, был обнаружен специфический белковый паттерн, состоящий из 26 белковых пиков по сравнению группой контроля. За исключением 4 белковых пиков (15 %), экспрессия остальных белковых пиков была увеличена по сравнению с группой контроля. 13 пиков (50 %) были связаны с саркоидозом во всей группе.

У пациентов с и без синдрома Лёфгрена наблюдались различия экспресиии 12 идентичных белковых объектов по сравнению с группой контроля. Эти 12 объектов составляют 46 % от всех пиков, идентифицированных в ЖБАЛ у пациентов с синдромом Лёфгрена и 32 % у пациентов без синдрома Лёфгрена.

Сравнение белкового паттерна в ЖБАЛ пациентов с или без синдрома Лёфгрена, показало 25 белковых пиков, экспрессия которых отличалось между этими группами пациентов. Из них только экспрессия 4 пиков (16 %) была увеличена у пациентов без синдрома Лёфгрена и экспрессия 21 (84 %) была увеличена у пациентов с синдромом Лёфгрена.

Идентификация дифференциально экспрессированных белков

Для идентификации дифференциально экспрессированных белков, были выполнены три процедуры: фракционирование с помощью обратнофазовой жидкостной хроматографии, SDS-PAGE и картирование с помощью метода фингерпринтов. Картирование полос в полиакриламидном геле указало на следующие белки, как наилучшие кандидаты для поиска по базе данных: предшественник протокадгерина-2 (m/z: 100.99 kD на Q10), человеческий серологический альбумин (m/z: 33.33 и 66.64 kD на CM10) и альфа1 антитрипсин (AAT; m/z: 44.43 kD на CM10).

Для доказательства, что дифференциальная экспрессия именно этих белков была обнаружена при анализе белковых чипов, была выполнена иммунодеплеция несконцентрированного ЖБАЛ. Исследование супернатанта после иммунодеплеции показало существенное уменьшение сигналов, соответствующих интересующим белковым пикам. В контрольном эксперименте, без использования специфических антител, пики были успешно обнаружены.

Обсуждение

Наше исследование, которое впервые использовало метод SELDI-TOF MS для анализа паттерна белковой экспрессии в несконцентрированном ЖБАЛ, показало, что у пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля, наблюдается дифференциальная экспрессия 40 белков. Из этих 40 белков, 13 наблюдались во всех рентгенографических стадиях и, поэтому, они могут быть белковыми объектами, непосредственно участвующими в патогенезе болезни (то есть, это могут быть белки, связанные с восприимчивостью к саркоидозу). Кроме того, были обнаружены белковые пики, специфические для различных рентгенографических стадий саркоидоза. Возможно, они могут действовать как модификаторы фенотипа болезни. Наши данные также говорят, что паттерн белковой экспрессии в ЖБАЛ у пациентов со стадией I саркоидоза, сильно зависит от присутствия синдрома Лёфгрена. Паттерн белковой экспрессии в ЖБАЛ у пациентов с синдромом Лёфгрена, весьма сильно различался не только от паттерна у пациентов без синдрома Лёфгрена, но также и белкового паттерна во всей группе. Наконец, картирование показало идентичность трех белков, обнаруженных с помощью SELDI-TOF MS, человеческому серологическому альбумину, альфа1 антитрипсину и ранее неизвестной молекуле (предшественник протокадгерина-2).

Исход саркоидоза вариабельный и располагается от острой болезни со спонтанной ремиссией до хронической болезни с прогрессом к фиброзу (4). Мы обнаружили 40 белковых объектов, экспрессия которых значительно отличалось от группы контроля. Из них, более 30 %, наблюдались во всех рентгенографических стадиях, что поддерживает концепцию, что в ранней стадии всех случаев саркоидоза имеется общее событие, характеризованное накоплением CD4+ T-клеток и активизированных макрофагов (4, 25, 37). Мы предполагаем, что число дифференциально экспрессированных белковых объектов в различных рентгенографических стадиях было значительно большим, но в нашем исследовании они не были статистически значимы из-за малого размера исследованной группы.

Мы предполагали, что белковый состав ЖБАЛ может изменяться в течение болезни, и поэтому изучили белковый паттерн в рентгенографических стадиях I, II и III. Радиологическая оценка вовлечения легкого была выбрана из-за наличия точных критериев (4, 31) и прогностической ценности (38). Рентгенографическая стадия I характеризуется внутригрудной лимфаденопатией, поэтому воспалительный компонент вероятно играет преобладающую роль в этой стадии. Однако, в нашем исследовании, наиболее динамичные изменения белкового профиля ЖБАЛ наблюдались у пациентов со стадией II. Эта стадия характеризуется не только лимфаденопатией, но также и поражением паренхимы легкого. Поэтому, в стадии II важную роль играет не только воспалительный ответ, но и локально произведенные белки, участвующие в поражении паренхимы. Рентгенографическая стадия III является ранней стадией развития рубцевания легкого. Мы предполагаем, что белки, специфические для стадии III, могут играть важную роль при формировании депозитов внеклеточного матрикса. Наиболее серьезная стадия саркоидоза, стадия IV, характеризуется фиброзными изменениями и не могла быть изучена в нашем исследовании из-за малого числа доступных образцов ЖБАЛ.

Мы также исследовали, имеют ли пациенты с синдромом Лёфгрена, который характеризуется присутствием узловатой эритемы, лихорадки, двусторонней внутрилимфаденопатии и артралгии (4), иной белковый профиль ЖБАЛ, чем пациенты без синдрома Лёфгрена. Кроме известных клинических различий, пациенты с синдромом Лёфгрена имеют общие генетические ассоциации, например аллели HLA-DQ, HLA-DR, CCR2 и TNF (39-42). Поэтому мы предположили, что белковый профиль ЖБАЛ может отражать эти различия. Действительно, мы обнаружили 25 белковых объектов, экспрессия которых значительно отличалось у пациентов с и без синдрома Лёфгрена. Интересно, что белковый паттерн ЖБАЛ у пациентов с синдромом Лёфгрена, характеризовался увеличенной экспрессией большинства (85 %) белковых объектов по сравнению с группой контроля и пациентами без синдрома Лёфгрена. Однако, у пациентов без синдрома Лёфгрена, пропорция белковых пиков с увеличенной и уменьшенной экспрессией была одинаковой с группой контроля (50% против 50 %). Интересно, что общее количество дифференциально экспрессированных белковых пиков, в целом было заметно ниже (на 40 %) у пациентах с синдромом Лёфгрена по сравнению с другими фенотипами саркоидоза. Обнаружение дополнительных белковых пиков в ЖБАЛ у пациентов с синдромом Лёфгрена, позволяет предположить, что эти белковые объекты могут быть связаны с эффективным разрешеним болезни, что совместимо с лучшим прогнозом пациентов с синдромом Лёфгрена. Мы впервое получили данные, что ЖБАЛ пациентов с и без синдромом Лёфгрена имеет различный белковый профиль.

Хотя процедура БАЛ использовалась в течение более чем 30 лет для диагностических целей при диффузных болезнях легкого (43, 44), информация относительно белкового состава ЖБАЛ крайне ограничена, что, по крайней мере частично, связано с методологическими проблемами. То, что при лаваже происходит растворение белков в растворе с высоким содержанием соли и некоторые белки имеют очень низкую концентрацию, необходимо проведение опреснения и концентрации, что приводит к существенной потере белков ЖБАЛ (45). Так как некоторые белки образуют комплексы с альбумином, высокая концентрация альбумина приводит к маскировке этих белков, что усложняет анализ ЖБАЛ (45). Однако, технология белковых чипов идеально подходит для протеомного анализа ЖБАЛ (46). Чувствительность метода SELDI-TOF MS составляет единицы фемтомолей, поэтому концентрирование ЖБАЛ не требуется. Также не требуется обессоливание ЖБАЛ, так как белки селективно фиксируются на белковых чипах. Еще одной выгодой метода SELDI-TOF MS является то, что белки с очень большой концентрацией не нарушают полученный белковый паттерн (47). Кроме того, неоднократно было показано, что метод имеет хорошую повторяемость и позволяет идентифицировать количественные различия между образцами (48-50).

С методологической точки зрения, пока не были сформулированы основные правила выполнения протеомных исследований и исследователи имеют возможность выбора дизайна эксперименов, включая статистический анализ и интерпретацию результатов (51). Особенно это относится к статистическому анализу большого количества данных. Можно применять поправку Бонферрони для множественных сравнений (52) или оставлять данные как есть (53). В этом исследовании мы впервые использовали метод SELDI-TOF MS для анализа ЖБАЛ при саркоидозе и поэтому решили не использовать статистическую обработку данных, как это было сделано в других протеомных исследованиях (46, 54, 55). Мы понимаем, что при этом имеется опасность получения ошибочных выводов, но мы полагаем, что это перевешивается сообщением о полном спектре белков-кандидатов для дальнейших, более детальных исследований. Кроме того, понимание, что в биологических жидкостях, таких как ЖБАЛ, содержится несметное количество белков, ценность статистической обработки результатов определить сложно.

Метод SELDI-TOF MS позволил проанализировать ЖБАЛ 65 пациентов с саркоидозом и 23 индивидуумов группы контроля. Напротив, исследования использующие 2D электрофорез в полиакриламидном геле, смогли проанализировать существенно меньшие группы, состоящие из 6-15 пациентов с саркоидозом и 3-11 индивидуумов группы контроля (11-16). В этих исследовниях изучались пациенты с саркоидозом с различными клиническими фенотипами и разнообразные по составу группы контроля: здоровые индивидуумы (12, 13), пациенты с идиопатическим легочным фиброзом (12, 14, 16) и пациенты с системным склерозом (16). Большинство дифференциально экспрессированных белков, идентифицированных в этих исследованиях (11-16) не были одинаковыми, вероятно из-за клинической гетерогенности относительно небольших групп пациентов, различиях в подборе групп контроля а также из-за различий в подготовке материала для исследования.

При исследовании белкового профиля ЖБАЛ, в нашем исследовании были идентифицированы три белка, серологический альбумин, альфа1 антитрипсин и протокадгерин -2. Человеческий серологический альбумин был обнаружен в большом количестве во всех рентгенографических стадиях, у пациентов с и без синдрома Лёфгрена. Увеличение уровней альбумина у наших пациентах вряд ли было вызвано его внезапным притоком при проведении бронхоскопии, так как у пациентов и в группе контроля использовалась аналогичная процедура лаважа. Высокие уровни альбумина в легких пациентов вероятно являются следствием увеличенной сосудистой проницаемости (56). Увеличение уровня альбумина в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом может быть связано с местным воспалением и, поэтому, использование уровней альбумина как индекса для нормализации белкового контента ЖБАЛ, может быть не легитимным (56-58).

Регулятор баланса протеаза-антипротеаза, альфа1 антитрипсин (59), был вторым белком, идентифицированным в нашем исследовании. Экспрессия этого белка была уменьшена во всей группе пациентов с саркоидозом. Однако, когда пациенты были разделены на группы согласно присутствия синдрома Лёфгрена, экспрессия альфа1 антитрипсина была уменьшена только у пациентов без синдрома Лёфгрена и была неизменной у пациентов с синдромом Лёфгрена. Поэтому, мы предполагаем, что неизменные, то есть физиологические уровни альфа1 антитрипсина у пациентов с синдромом Лёфгрена, были связаны с ранним спонтанным разрешением болезни. Эта интерпретация согласуется с ролью альфа1 антитрипсина в качестве модулятора воспалительного ответа (60-62). Принимая во внимание, что ключевые воспалительные медиаторы (фактор некроза опухоли альфа, интерлейкин-6, MCP-1 и т.д.) ингибируются нормальными уровнями альфа1 антитрипсина (61), производство этих цитокинов усиливается при более низких уровнях альфа1 антитрипсина (62). Поэтому, уменьшение экспрессии альфа1 антитрипсина может стимулировать экспрессию фактора некроза опухоли альфа и других провоспалительных медиаторов и, таким образом, поддерживать воспаление у пациентов без синдрома Лёфгрена.

Экспрессия предшественника протокадгерина-2, третьего белока, идентифицированного в нашем исследовании, была увеличена во всех изученных фенотипах саркоидоза. Прокадгерины принадлежат семейству кадгегинов суперсемейства молекул адгезии. Их функции изучены плохо (63). Предлагалось, что помимо слабых адгезионных свойств, протокадгерин-2 может, подобно другим протокадгеринам, обладать дополнительными биологическими действиями, например подавлением роста опухоли (64, 65). Однако, до настоящего времени, данных о вероятной роли предшественника протокадгерина-2 при легочных болезнях нет, и, поэтому, важность увеличения экспрессии предшественника протокадгерина-2 при саркоидозе должна быть разъяснена.