Sarcoidosis Vasculitis And Diffuse Lung Diseases 2008; 25; 15-20

Количественный анализ ДНК пропионовых бактерий в клетках ЖБАЛ пациентов с саркоидозом

H. Ichikawa, M. Kataoka, J. Hiramatsu, M. Ohmori, Y. Tanimoto, A. Kanehiro, Y. Nakata, M. Tanimoto
Department of Hematology, Oncology and Respiratory Medicine, Faculty of Health Sciences, Okayama University Medical School, Okayama city, Okayama, Japan

Реферат

Цель: причина саркоидоза все еще неизвестна. Предполагается, что пропионовые бактерии являются одним из наиболее вероятных источников саркоидного антигена. Мы попытались измерить количество ДНК пропионовых бактерий в клетках ЖБАЛ пациентов с саркоидозом и с другими легочными болезнями. Методы: мы исследовали клетки ЖБАЛ 42 пациентов с саркоидозом и 30 индивидуумов контрольной группы. Используя количественную ПЦР для 16S rRNA Propionibacterium acnes (P. acnes) и Propionibacterium granulosum (P. granulosum), мы измерили количество ДНК пропионовых бактерий в 500 ng ДНК, извлеченной из клеток ЖБАЛ от пациентов с саркоидозом или другими болезнями легкого. Корреляция между клиническими данными и результатами количественной ПЦР была проанализирована. Результаты: средний уровень ДНК P. acnes у пациентов с саркоидозом был 59.9 геномов в 500 ng ДНК, что значительно выше, чем в контрольной группе (20.7 генома, p < 0.0001). Средний уровень ДНК P. granulosum у пациентов с саркоидозом был 1.2 генома, что подобно контрольной группе (1.0 ±1.6 генома, p=0.52). Число геномов P. acnes в клетках ЖБАЛ коррелировало с серологическим уровнем АПФ и процентом макрофагов в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом. Заключение: количество ДНК P. acnes в клетках ЖБАЛ пациентов с саркоидозом было значительно выше, чем у пациентов с другими легочными болезнями. P. acnes может участвовать в патогенезе саркоидоза.

Введение

Хотя со времени первого сообщения о саркоидных повреждениях прошло более 100 лет, причины этой системной гранулематозной болезни все еще остаются неизвестными. Саркоидоз происходит у людей во всем мире, во всех расах и возрастах, поэтому, предполагалось, что этиология саркоидоза одинакова во всем мире. Предполагается, что саркоидоз происходит при воздействии на наследственно восприимчивого индивидуума специфических факторв окружающей среды (1). Микобактерии и пропионовые бактерии считаются наболее вероятными причинными агентами саркоидоза (2). Некоторые исследователи с помощью ПЦР обнаружили микобактериальную ДНК в ткани пациентов с саркоидозом, но другим это сделалать не удалось.

Используя ПЦР, Gazouli с коллегами показали наличие геномов P. granulosum (43.8 %) и M. tuberculosis (71.7 %) в образцах тканей (легкое и лимфатические узлы) пациентов с саркоидозом (3). В различных исследованиях частота обнаружения ДНК различных организмов различалась очень сильно (от 0 до 89 %) (2). Однако, ни одно исследование не смогло изолировать M. tuberculosis в культуре саркоидных тканей. Поэтому, имеется ли связь между микобактериями и патогенезом саркоидоза, остается спорным.

P. acnes - пока единственная бактерия, которая была изолирована в культуре биопсийной ткани пациентов с саркоидозом (4, 5). Eishi с коллегами обнаружили геномы пропионовых бактерий в лимфатических узлах пациентов с саркоидозом и предположили этиологическую связь между саркоидозом и Propionibacterium spp. (6-8). Nishiwaki с коллегами показали, что внелегочная сенсибилизация к P. acnes вызывала легочные Th1 гранулемы и эрадикация природных P.acnes с помощью антибиотиков, уменьшала гранулематозные повреждения легкого (9). Ранее мы сообщили, что частота обнаружения ДНК P. acnes в клетках ЖБАЛ с помощью ПЦР была значительно выше у пациентов с саркоидозом (10). Мы также сообщили, что бластогенез, производство IL-2 и экспрессия рецепторов IL-2 альвеолярных лимфоцитов, стимулированных P. acnes, были больше у пациентов с саркоидозом чем у пациентов с другими болезнями легкого и в здоровой контрольной группе (11, 12). Недавно McCaskill с коллегами показали, что P. acnes вызывали доминирующий Th1 иммунный ответ и перибронховаскулярное гранулематозное воспаление в экспериментальных моделях (13). В этом исследовании, мы попытались измерить число геномов P. acnes и P. granulosum в клетках ЖБАЛ пациентов с и без саркоидоза с помощью количественной ПЦР и коррелировали результаты с клиническими данными пациентов.

Пациенты

Образцы ЖБАЛ были получены у пациентов с саркоидозом, давших письменное информированное согласие. Исследование было одобрено комитетом по этике Okayama University Hospita. Бронхоскопия была выполнена в диагностических целях в период с июня 1997 г. до апреля 2005 г. в Okayama University Hospita. В исследование было включено 42 пациента с саркоидозом, из которых 4 имели стадию 0, 15 пациентов стадию I, 16 пациентов стадию II и 7 пациентов стадию III. Контрольная группа из 30 пациентов с другими болезнями легкого состояла из 12 пациентов с интерстициальной пневмонией, 10 пациентов с раком легкого и 8 пациентов с другими болезнями легкого.

Диагноз саркоидоз был установлен на основании гистологических результатов, совместимых с саркоидозом, клинических данных (увеличенный уровень АПФ, отрицательная туберкулиновая кожная проба, увеличение процента лимфоцитов и отношения CD4/CD8 в ЖБАЛ) и отсутствии текущей инфекции M. tuberculosis или другими организмами, способными производить гранулематозные повреждения.

Результаты

Число геномов P. acnes у пациентов с саркоидозом было 59.9 ± 42.0 копий в 500 ng ДНК, что значительно выше, чем у пациентов с другими болезнями легкого (20.7 ± 12.6 копий, p < 0.0001). Не имелось различий в числе геномов P. granulosum между пациентами с саркоидозом (1.2 ± 1.5 копии в 500 ng ДНК) и без саркоидоза (1.0 ± 1.6 копия, p=0.52). Число геномов P. acnes в клетках БАЛ пациентов с саркоидозом было в 50 раз выше, чем число геномов P.granulosum. Не имелось существенной корреляции между количеством ДНК P. acnes и отношением CD4/CD8 В ЖБАЛ. Однако, число геномов P. acnes в клетках ЖБАЛ сильно коррелировало с серологическим уровнем АПФ (r=0.361, p < 0.05) и с процентом макрофагов в ЖБАЛ (r=0.360, p < 0.05). Не имелось существенных различий в среднем уровне ДНК P. acnes у пациентов с различными рентгенографическими стадиями или различными результатами скеннограммы с галлием-67.

Обсуждение

Хотя саркоидоз, вероятно, происходит при воздействии на наследственно восприимчивого индивидуума специфических факторв окружающей среды, его этиология все еще неизвестна. Хотя многие возможные причинные агенты, особенно инфекционные, включая микобактерии, вирус герпеса и Borrelia burgdorferi, интенсивно изучились, ни один причинный агент не был идентифицирован как причина саркоидоза. P. acnes, анаэробные грамм-положительные бактерии, комменсалы кожи и слизистых оболочек (14), являются единственными бактериями, которые были изолированы из саркоидных повреждений (4). Эти бактерии расцениваются как один из наиболее вероятных кандидатов в причинные агенты саркоидоза. Действительно, в экспериментальных моделях, P. acnes вызвали легочные гранулемы у мышей (9, 13, 15, 16) и увеличение уровней Th1 цитокинов и хемокинов (13). Эндотрахеальное введение P. acnes несенсибилизированым C57BL/6 мышам не стимулировало развитие гранулематозных изменений (9, 17). С другой стороны, Nishiwaki с коллегами сообщили, что внутривенное введение C57BL/6 мышам клеток Т-хелпер, подвегнутых первичному воздействию P. acnes, после иммунизации подкожным введением убитых высокой температурой P. acnes, вызвали гранулематозные изменения в легком (9). Эндотрахеальное введение P. acnes после интраперитонеального введения убитых высокой температурой P. acnes вело к развитию легочного гранулематоза (13). Yi сообщил о гранулематозном воспалении после эндотрахеального ведения убитых высокой температурой P. acnes у сенсибилизованных крыс (15). Внутривенное введение P. acnes производило легочное гранулематозное воспаление у сенсибилизованных кроликов и крыс (15, 16). Похоже, предварительная сенсибилизация P. acnes необходима для развития индуцированного P. acnes легочного гранулематоза в животных моделях.

Мы исследовали клетки ЖБАЛ на количество ДНК P. acnes и P. granulosum и обнаружили, что число геномов P. acnes у пациентов с саркоидозом было значительно больше, чем у пациентов с другими легочными болезнями. Однако, не имелось различия в числе геномов P. granulosum между этими двумя группами и, кроме того, число геномов P. granulosum был намного меньше, чем количество геномов P. acnes у пациентов с саркоидозом. Результаты этого исследования согласуются с нашими предыдущими результатами (10). Ранее, Японские исследователи обнаружили этиологическую корреляцию между P. acnes и саркоидозом (6-8). Они сообщили, что число геномов P. acnes в лимфатических узлах пациентов с саркоидозом было намного выше, чем в лимфатических узлах пациентов с другими легочными болезнями (6, 7) и также сообщили о накоплении геномов P. acnes внутри и вокруг саркоидных гранулем (8).

Они также сообщили, что все пациенты с саркоидозом без P. acnes в лимфатических узлах, имели ДНК P. granulosum (6). В этом отношении, их результаты отличались от наших, поскольку мы не обнаружили существенного числа геномов P. granulosum. Это различие может быть следствием использования различных источников клеток (лимфатические узлы против клеток ЖБАЛ) или чувствительности ПЦР. В любом случае, наши результаты подразумевают, что P. granulosum не участвуют в патогенезе саркоидоза. Ранее мы сообщили о иммунном ответе на P. acnes клеток ЖБАЛ пациентов с саркоидозом. При стимуляци экстрактом P. acnes, пролиферативный ответ клеток ЖБАЛ пациентов с саркоидозом был выше чем ответ клеток ЖБАЛ пациентов с другими болезнями легкого и здоровой контрольной группы (11).

Производство IL-2 и экспрессия рецепторов IL-2 у клеток ЖБАЛ, стимулируемых P. acnes, были больше у пациентов с саркоидозом, чем в контрольной группе (12). Кроме того Nishiwaki с коллегами продемонстрировали P. acnes -специфическую пролиферацию лимфоцитов в легочных лимфатических узлах у мышей (9). Эти данные говорят, что альвеолярные лимфоциты и лимфоциты лимфатических узлов уже были подвергнуты воздействию P. acnes.

Хотя в течение долгого времени считалось, что нижний респираторный тракт не содержит P. acnes, недавние исследования показали наличие P. acnes в легком у 8 (33 %) из 24 мышей (18). Кроме того, иммуноокрашивание показало существование P. acnes (живые бактерии или компоненты фагоцитированных бактерий) в цитоплазме альвеолярных макрофагов в легких нормальных мышей (9) и в легких при саркоидозе (10). В нашем исследовании, число геномов P. acnes у пациентов с саркоидозом было связана с процентом макрофагов в ЖБАЛ.

Уровень АПФ, который был увеличен у пациентов с саркоидозом, был связан с числом геномов P. acnes. Это указывает, что может иметься связь между числом саркоидных гранулем или альвеолярных макрофагов и числом геномов P. acnes, поскольку эпителиоидные клетки и макрофаги при саркоидозе производят АПФ (19).

Возможность контаминации P. acnes при проведении бронхоскопии или при проведении экспериментов была исключена. Наши наблюдения говорят, что P. acnes могут быть резидентами нижнего респираторного тракта. Легочные гранулемы у пациентов с саркоидозом могут происходить вследствие аллергической реакции замедленного типа к P. acnes, которые могут играть основную роль в иммунном ответе в легких пациентов с саркоидозом.