American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine Vol 174. pp. 915-922, (2006)

Функциональный полиморфизм простагландин-эндопероксид синтазы 2 позволяет предсказать неблагоприятный исход саркоидоза

Michael R. Hill, Anastasia Papafili, Helen Booth, Phillippa Lawson, Marianne Hubner, Huw Beynon, Catherine Read, Gisela Lindahl, Richard P. Marshall, Robin J. McAnulty and Geoffrey J. Laurent
Centre for Respiratory Research, Department of Medicine, Royal Free and University College Medical School, The Rayne Institute; Department of Rheumatology, Royal Free Hospital, London, United Kingdom; and Wilhelminenspital, Vienna, Austria

Реферат

Введение: у большинства пациентов с саркоидозом болезнь разрешается, однако у 5-10 % пациентов с саркоидозом развивается легочный фиброз с неблагоприятным прогнозом. Простагландин-эндопероксид синтаза 2 (PTGS2) - ключевой регулирующий фермент при синтезе антифиброзного простагландина E2 и его активность в легком при саркоидозе уменьшена. Полиморфизм промотора гена PTGS2 -765G > C, уменьшает его экспрессию. Цель: исследовать, связан ли полиморфизм -765G > C с восприимчивостью к саркоидозу и неблагоприятным исходом и изучить возможный механизм действия полимофизма -765G > C на уменьшение экспрессии PTGS2. Методы: мы использовали исследование дизайна случай-контроль и генотипировали 198 белых Британских пациентов с саркоидозом и 166 индивидуумов в группе контроля. До проведения генотипирования, у пациентов с саркоидозом болезнь была классифицирована как персистирующая или не персистирующая, используя клинические критерии, которые включали рентгенографическую стадию, потребность в терапии и функцию легкого. Изменение подвижности белков при электрофорезе использовались, чтобы идентифицировать изменение сцепления фактора транскрипции, вызванное полиморфизмом -765G > C. Результаты: аллель -765C был сильно связан с восприимчивостью к саркоидозу (OR 2.50; доверительный интервал 95 %, 1.51-4.13; p = 0.006) и у пациентов с саркоидозом с более неблагоприятным исходом (OR 3.11; доверительный интервал 95 %, 1.35-7.13; p = 0.008). Изменения подвижности белков при электрофорезе показали, что аллель -765C вызывает потерю сцепления фактора транскрипции с Sp1/Sp3 и увеличение сцепления с Egr-1. Заключение: наши данные говорят, что полиморфизм -765G > C позволяет идентифицировать индивидуумов, которые восприимчивы к саркоидозу и, что, более важно, имеют риск развития фиброза. Измененное сцепление Sp1/Sp3 и -765 может участвовать в механизме, посредством которого -765G > C уменьшает экспрессию PTGS2.

Введение

Саркоидоз - мультисистемная болезнь, характеризованная хроническим воспалением и формированием гранулем. Саркоидоз поражает до 40 индивидуумов на 100,000 каждый год, с пораженеим легкого в почти всех случаях (1-4). Причины развития саркоидоза остаются неясными, однако, генетическая восприимчивость является важным фактором (5). Степень поражения легкого при саркоидозе является вариабельной, в пределах от самоограниченных инфильтратов, которые разрешаются спонтанно, до хронического прогрессирующего фиброза, который происходит у 5-10 % пациентов. До недавнего времени, маркеров, которые позволяют идентифицировать индивидуумов с неблагоприятным исходом саркоидоза, не было. Однако, недавно появились данные, что уменьшение экспрессии простагландин-эндопероксид синтазы 2 (PTGS2) или циклооксигеназы-2 при фиброзных болезнях легкого, включая саркоидоз, влияет на регулирующие механизмы, которые ограничивают прогресс фиброзной болезни (6-9).

PTGS2 - изоформа простагландин-эндопероксид синтазы 2 (также известная как циклооксигеназа) участвующая в ферментативной конвертации арахидоновой кислоты в простаноиды. Простаноиды обеспечивают важный гомеостатический контроль в нормальных тканях и регулируют воспаление (10). Простагландин E2 (PGE2) - основной простаноид, произведенный в нормальном легком при увеличение активности PTGS2, с концентрацией в 50 раз больше, чем концентрация других продуктов PTGS (11). Это основной простаноид, произведенный фибробластами легкого и имеет бронхопротективный эффект, ингибируя пролиферацию и дифференцирование миофибробластов а также синтез коллагена (6, 12-14). Однако, при легочном фиброзе, уровни PGE2 в легком уменьшены более чем на 50 % (15), несмотря на увеличенные уровни медиаторов, которые стимулируют его синтез. Мы показали, что фибробласты из легких пациентов с легочным фиброзом не в состоянии увеличивать производство PGE2 в ответ на воспалительные и профибротические медиаторы, такие как IL-1, фактор некроза опухоли альфа и трансформирующий фактор роста бета (TGF-beta) (6-8). Это проиходит из-за уменьшения способности стимулировать экспрессию PTGS2 (6, 7), а не из-за различия экспрессии PTGS1, изменения производства субстратов арахидоновой кислоты или простаноидов PTGS2 (6, 7). Эти клетки демонстрируют нормальный ответ на экзогенный PGE2, предполагая, что они имеют нормальную экспрессию рецепторов PGE2 (6, 7). PTGS2-дефицитные мыши имеют усиленный фиброзный ответ в легком в ответ на блеомицин (6, 16). Кроме того, серьезность поврежедений у этих мышей зависит уменьшения производства PGE2 (17).

Мы полагали, что нарушение экспрессии PTGS2 может происходить из-за недавно описанного полиморфизма промотора -765G > C (18). Аллель -765C на 30 % уменьшает активность промотора по сравнению с аллелем -765G, и при системном воспалительном ответе, величина увеличения уровней C-реактивного белка (CRP) после операции аорто-коронарного шунтирования сильно зависела от генотипа, причем аллель -765C значительно снижает уровни CRP (18). Кроме того, недавно было показано, что аллель -765C является защитным от инфаркта миокарда и инсульта (19), предполагая, что полиморфизм -765G > C имеет важную роль при хроническом воспалении. На основании этих исследований, мы выдвинули гипотезу, что аллель -765C участвует в развитии фиброзной болезни при саркоидозе. Мы исследовали, связан ли полиморфизм -765G > C восприимчивостью и неблагоприяным исходом саркоидоза и изучили возможный механизм, посредством которого -765G > C уменьшает экспрессию PTGS2. Некоторые из результатов этих исследований ранее были сообщены в форме резюме (20, 21).

Пациенты

Все пациенты из Великобритании в этом исследовании были белыми британцами, все Австрийские пациенты были белыми Австрийцами. Саркоидоз был диагностирован на основании руководящих принципов ATS/ERS/WASOG (1). Пациенты из Великобритании с легочным саркоидозом (n = 198; 119 женщин, 79 мужчин; средний возраст, 39.5 ± 11.5 лет) был привлечены из University College London Hospitals, Royal Free и St. Georges Hospitals (London, UK). Группа контроля (n = 166; 77 женщины, 89 мужчин; средний возраст 41.4 ± 10.9 лет) была привлечена через службу переливания крови Лондона (National Blood Service, London, UK). Австрийские пациенты с легочным саркоидозом (n = 76; 46 женщин, 30 мужчин; средний возраст 43.5 ± 11.9 лет) были привлечены в исследование из Wilhelminenspital, Вена, Австрия. Группа контроля (n = 130; 75 женщин, 55 мужчин; средний возраст 44.3 ± 18.9 лет) были привлечены из службы переливания крови Wilhelminenspital, Вена. Ни один из пациентов с саркоидозом в этом исследовании не получал нестероидные противовоспалительные средства. Исследование было одобрено комитетом по этике и письменное информированное согласие было получено у всех участников.

Рентгенограммы легких были оценены радиологом без знания генотипов пациентов. Использовалась стандартная система рентгенографических стадий (1). Пациенты со стадией IV, с потерей объема, искажением архитектуры легкого, и/или кистозно-фиброзной болезнью, были классифицированы в группу с персистирующей болезнью. Остальные пациенты были оценены по крайней мере через 2 года после постановки диагноза. Пациенты со стадией II или III, которые имели симптоматическую болезнь легкого и нуждались в терапии а также имели патологию функцию легкого (FVC и/или TLC и/или DLco) < 80 % от должного, также классифицировались в группу с персистирующим легочным саркоидозом. Пациенты со стадией II или III, которые не удовлетворяли этим требованиям и пациенты со стадией 0 или I по крайней мере через 2 года после постановки диагноза, классифицировались в группу с не персистирующим легочным саркоидозом.

Результаты

Полиморфизм -765G > C у пациентов с саркоидозом и в группе контроля

Частота аллеля -765C в Британской группе контроля (OR, 0.10; 95 % CI, 0.07-0.13) была подобна ранее сообщенной (18) и значительно отличалась у пациентов с легочным саркоидозом (OR, 0.20; 95 % CI, 0.16-0.24; p = 0.001). Британская группа контроля была согласована с пациентами по возрасту (41.4 ± 10.9 лет и 39.5 ± 11.5 лет, соответсвенно; p = 0.11) но отличалась по распределению полов, 46.4 % женщин в группе контроля; 60.1 % женщин среди пациентов с саркоидозом; p = 0.009. Хотя не имелось свидетельств связи между полом и генотипом (p = 0.392), влияние полиморфизма -765G > C было самым сильным у женщин с саркоидозом. В целом, редкий аллель -765C был связан с увеличенной восприимчивостью к саркоидозу (OR, 2.50; 95 % CI, 1.51-4.13) при объединении генотипов GC и CC (p = 0.006). У женщин с саркоидозом OR был 3.17 (95 % CI, 1.53-6.56; p = 0.002). В целом, пациенты с генотипом GC имели OR 2.40 (95 % CI, 1.42-4.06; p = 0.001), а пациенты с генотипом CC имели OR 3.40 (95 % CI, 0.89-13.05; p = 0.075).

Результаты для Австрийских пациентов с саркоидозом были аналогичны с Британскими пациентами. Пациенты с саркоидозом и группа контроля были согласованы по возрасту (44.3 ± 18.9 лет и 43.5 ± 11.9 лет, соответственно; p = 0.76) но отличалась по распределению полов, 57.7 % женщин в группе контоля; 60.5 % женщин среди пациентов с саркоидозом. Среднее время болезни было значительно меньше у Австрийских пациентов по сравнению с Британскими (2.4 ± 2.0 года против с 8.9 ± 8.2 года, соответственно; p = < 0.001). Большинство Австрийских пациентов с саркоидозом (93.5 %) имели стадию II/III легочного саркоидоза, по сравнению с Британскими пациентами, из которых 50.8 % имели стадию 0/I, 24.3 % стадию II/III и 24.9 % стадию IV легочного сакроидоза. Британские и Австрийские пациенты имели подобную частоту лечения кортикостероидами и ухудшения функции легкого (TLC и DLco). Однако, FEV1 и FVC, отличались между этими двумя группами. У Австрийских пациентов, аллель -765C был связан с восприимчивостью к саркоидозу (OR, 1.91; 95 % CI, 1.04-3.49; p = 0.036). Подобно Британским пациентам, эффект полиморфизма -765G > C был самым сильным по женщин (OR 3.35, 95 % CI, 1.47-7.64; p = 0.004).

Связь -765G > C с персистирующей и не персистирующей болезнью

У пациентов с саркоидозом, болезнь классифицировались как персистирующая или не персистирующая на основании вышеуказанных критериев. 20 пациентов не были классифицированы, потому у них не было доступных для анализа рентгенограмм через 2 года после постановки диагноза (n = 19) или потому что они наблюдались менее 2 лет после постановки диагноза (n = 1). Из остальных пациентов, у 76 болезнь была классифицирована как персистирующая и у 102 как не персистирующая. Эти две группы не отличались по возрасту (p = 0.17), полу (p = 0.19), использованию кортикостероидов (p = 0.47) или статусу курения (p = 0.22), но значительно отличались по рентгенографической стадии, функции легкого и продолжительности болезни. Компьютерная томография с высоким разрешением (КТВР) подтвердила присутствие фиброза у 23 пациентов. 10 из этих пациентов имели рентгенографическую стадию IV, 6 стадию II и 7 стадию III. Однако, у всех этих пациентов болезнь могла быть категоризирована как персистирующая без проведения КТВР. Частота полиморфизма -765G > C значительно отличалась между пациентами с персистирующей (OR, 0.26; 95 % CI, 0.19-0.33) и не персистирующей болезнью (OR, 0.13; 95 % CI, 0.08-0.17) (p = 0.005). Частота полиморфизма -765G > C у пациентов с не персистирующей болезнью была подобна частоте в группе контроля (OR, 0.10; 95 % CI, 0.07-0.13). Носительство редкого аллеля -765C было связано с неблагоприятным исходом болезни (OR, 3.11; 95 % CI, 1.35-7.13; p = 0.008). Влияние полиморфизма -765G > C было самый сильный у женщин с саркоидозом, OR 5.49 (95 % CI, 1.82-16.59; p = 0.003). Существенного влияния генотипа на рентгенографическую стадию и функци легких через 2 года после постановки диагноза обнаружено не было, однако, наблюдалась тенденция уменьшения TLC и DLCO (% от должного) у пациентов, несущих аллель -765C.

Несколько Австрийских пациентов с саркоидозом не имели доступных клинических данных через 2 года после постановки диагноза. Кроме того, эта группа была намного меньше, чем группа Британских пациентов с саркоидозом. Это не позволило выяснить, связан ли полиморфизм -765G > C с неблагоприятным исходом саркоидоза у Австрийских пациентов.

Влияние полиморфизма -765G > на синтез PGE2 легочными фибробластами

Влияние полиморфизма -765G > на синтез PGE2 было исследовано на линиях фибробластов легкого, которые стимулировались трансформирующим фактором роста бета 1 (TGF-beta1). Были исследованы 9 линий клеток; 7 были гомозиготными для аллеля -765G (GG) и 2 были гетерозиготными для -765G > C (GC). Линии клеток с генотипом GC не производили или производили небольшое количество PGE2 и увеличение производства не стимулировались TGF-beta1. Базальное производство PGE2 линиями клеток с генотипом GG располагалось от 31 до 2720 pg/10⁵ клеток (среднее значение 670 pg/10⁵ клеток) и производство увеличивалось в 14 раз при стимуляции TGF-beta1 (диапазон, 55-3200 pg/10⁵ клеток; среднее значение 1,084 pg/10⁵ клеток).

Сцепление ядерного белка с регионом -765 PTGS2 промотора

Эксперименты показали, что полиморфизм -765G > C изменяет сцепление фактора транскрипции с регионом -765. Эксперимент с hrecSp1 подтвердил, что Sp1 мог связываться с регионом, содержащим -765G; однако, это сцепление нарушалось в присутствии -765C. Когда использовались ядерные экстракты легочных фибробластов, формировалось множество комплексов. Исследования с помощью специфических антител показали, что в сцеплении с этим регионом участвуют белки Sp1, Sp3 и Egr-1, но что эти белки дифференциально связывают аллели -765G и -765C. Было обнаружено небольшое число неопознанных белковых комплексов, на которые эти антитела не влияли. Комплекс SS1 был получен при использовании антител anti-Sp1 в присутствии -765G, но не -765C, принимая во внимание, что антитела anti-Sp3 предотвращали формирование комплекса II, который наблюдался только в присутствии -765G. Антитела к Sp2 и Sp4 не имели никакого очевидного эффекта. Антитела, специфические для Egr-1 производили комплекс SS2 в присутствии -765C и уменьшали интенсивность комплекса I, который формировался с -765G.

Обсуждение

Полиморфизм -765G > C связан с саркоидозом и позволяет предсказать неблагоприятный исход болезни

В этом исследование мы впервые сообщили о связи генотипов PTGS2 с саркоидозом. Носительство редкого -765C аллеля, связанное с полиморфизмом -765G > C, связано с восприимчивостью к саркоидозу у Британских пациентов. Эти результаты были подтверждены в группе пациентов из Австрии. Связь аллеля -765C с саркоидозом в Великобритании была обнаружена из-за присутствия пациентов с персистирующей болезнью (47 % пациентов с персистирующей болезнью саркоидоза имели -765C аллель, по сравнению с 18 % группы контроля и 23 % пациентов с не персистирующим саркоидозом), предполагая возможность использования полиморфизма -765G > C как маркера, позволяющего предсказать риск неблагоприятного исхода болезни.

Саркоидоз поражает легкие почти у всех пациентов. Легочные проявления могут разрешаться спонтанно или прогрессировать к легочному фиброзу, дыхательной недостаточности и смерти. Идентификация индивидуумов, которые вероятно будут иметь неблагоприятный прогноз является трудной. В начале исследования, мы использовали систему классификации, которая позволяет разделить пациентов с персистирующим / фиброзным легочным саркоидозом и с не персистирующим / не фиброзным легочным саркоидозом, которая была основана на комбинации рентгенограммы, функции легкого, потребности в лечении и продолжительности болезни. Известно, что рентгенографическая стадия может использоваться как прогностический фактор при легочном саркоидозе (25). Данные КТВР подтверждали присутствие фиброза и демонстрировали свидетельства фиброза у пациентов, которые не имели стадии IV болезни. Это не удивительно, поскольку КТВР значительно более чувствителеный метод, чем рентгенограмма. Однако, при использовании нашей системы классификации, все пациенты со стадией II или III болезни, которые имели признаки фиброза на КТВР, были категоризированы в группу с персистирующей болезнью. Это указывает в необходимости нескольких критериев, которые позволят точно определить исход саркоидоза. Нарушения функции легкого при саркоидозе являются комплексными, однако, было показано, что FVC и DLco обратно пропорционально коррелировали со степенью ретикулярных изменений паттерна КТ (26). Потребность в терапии была включена в нашу систему классификации, чтобы отразить наличие у пациентов прогрессирующей симптоматической легочной болезни, как рекомендуется в международном соглашении (1). Продолжительность болезни также является важной, потому что спонтанное разрешение стадии рентгенографической стадии II и выше через 2 года после постановки диагноза является маловероятным (1). Ненормальности КТ также редко разрешаются через 2 года (29). Используя эти критерии, мы обнаружили сильную связь аллеля -765C с персистирующей / фиброзной болезнью, которая связана с уменьшением экспрессии PTGS2, играющей важную роль в фиброзной реакции, связанной с фибропролифративными болезнями легкого (6, 7). Существенного влияния генотипа на рентгенорафическую стадию и функции легкого обнаружено не было, когда они рассматривались как независимые переменные.

Роль полиморфизма -765G > C при других воспалительных состояниях

После нашего начального сообщения, описывающего полиморфизм -765G > C (18), несколько групп также исследовали этот полиморфизм (19, 30, 31). Ранее мы сообщили, что аллель -765C может быть протективным при системном воспалительном ответе на основании его связи с уменьшенными уровнями С-реактивного белка. С-реактивный белок - известный показатель неблагоприятного исхода при операции аорто-коронарного шунтирования. Cipollone с коллегами недавно подтвердили наше начальное наблюдение относительно уменьшения плазменных уровней С-реактивного белка у носителей аллеля -765C в проспективном исследовании сердечно-сосудистой болезни (19). Однако, также сообщалось, что женщины с генотипом -765CC восприимчивы к развитию диабета второго типа и бронхиальной астмы (30, 31). Факт, что аллель -765C имеет протективную роль при сердечно-сосудистой болезни но участвует в восприимчивости к другим болезням, включая фиброзную болезнь легкого, является совместимым с тем, что PTGS2 имеет провоспалительную, противовоспалительную и антифиброзную роль (6, 17, 32).

Полиморфизм -765G > C является функциональным и может участвовать в регулировании транскрипции посредством изменения сцепления Sp1/Sp3 и Egr-1

В ранее проведнном исследовании репортерного гена фибробластов легкого, мы показали, что полиморфизм -765G > C является функциональным, причем аллель -765C связан с более низкой активностью промотора, чем -765G (18). Мы полагали, что аллель -765C у фибробластов легкого может быть связан с уменьшеним синтеза PGE2. Предварительные данные нашего исследования поддерживают это предполопжение, однако, результаты должны быть подтверждены в большом исследовании. Несколько других исследований искали корреляцию генотипов -765G > C с биологическими маркерами болезни, включая С-реактивный белок, металлопротеиназы и простагландины, однако, результаты этих исследований противоречивы (18, 19, 31).

Полиморфизм -765G > C расположен в пределах предполагаемого мотива Sp1 фактора транскрипции, что может объяснять его функциональность. При использовании ядерных экстрактов, полученных из фибробластов легкого и при блокировании реакций с помощью специфических антител, мы обнаружили, что что Sp1 и Sp3 замещаются при сцеплении, когда присутствует аллель -765C. В присутствии аллеля -765C, наблюдается сцепление с Egr-1. В большинстве промоторов, Sp1 и Sp3 опознают классический элемент Sp1 5'GGGGCGGGG3 ' с сопоставимой аффинностью и специфичностью (33). Поэтому, не удивительно, что смещение сцепления Sp1 с регионом -765 также сопровождается смещением Sp3 в присутствии -765C аллеля. Отношение Sp1/Sp3 часто является критическим для активации гена. Sp1 - типичный транскрипционный активатор, который требуется для экспрессии разнообразных генов (34). Однако, Sp3, скорее всего является бифункциональным регулятором, который действует как репрессор или активатор, чья активность зависит от контекста участка сцепления промотора (34, 35). Egr-1 также связывается с GC-богатыми последовательностями ДНК (5 '-GCGGGGGCG-3 ') и способен заместить Sp1 в большом количестве промоторов. Egr-1 действует прежде всего как транскрипционный индуктор экспрессии гена, с мощным действием на профибротические гены, такие как тромбоцитарный производный фактор роста, TGF-beta и фактора некроза опухоли альфа. Однако, замещение Egr-1 Sp1 также может приводить к репрессии транскрипции (36, 37). Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, действует ли Egr-1 как репрессор или как менее мощный активатор транскрипции PTGS2 у фибробластов легкого и исследовать, зависят ли взаимоотношения Sp1/Sp3 и Egr-1 от типа клеток. Это может помочь объяснить противоречия результатов исследования функциональных эффектов полиморфизма -765G > C (18, 31). В транскрипционном регулировании в регионе -765 могут участвовать другие факторы транскрипции. Большое число комплексов, обнаруженных в нашем исследовании говорит, что ядерные белки, иные чем Sp1, Sp3 и Egr-1, могут связываться с этим регионом.

Клинические проявления

Результаты этого исследования указывают, что аллель PTGS2 -765C - многообещающий кандидат для геномного исследования, который может помочь идентифицировать пациентов с саркоидозом, которые имеют больший риск прогрессирующей фиброзной болезни и у которых может проводиться более агрессивная или более специфическая антифиброзная терапия. Влияние полиморфизма -765G > C является самым сильным у женщин. Женский пол - известный фактор риска саркоидоза. Также важно исследовать полиморфизм -765G > C в других этнических группах. Афро-американцы имеют более высокую распространенность и более серьезную форму саркоидоза, чем белые пациенты. Сообщалось, что частота полиморфизма -765G > C намного выше у афро-американцев (38). При терапии саркоидоза чаще всего используются кортикостероиды. Однако, их эффективность в поздней фиброзной стадии саркоидоза ограничена, что может быть связано с текущей концепцией патогенеза легочного фиброза, указывая, что паракринные взаимодействия между клетками, скорее чем хроническое воспаление, ведут у прогрессу легочного фиброза (39, 40). Поэтому, идентификация пациентов с большим риском фиброза, например несущих аллель PTGS2 -765C, позволит проводить более агрессивную иммуносупрессивную терапию у этих пациентов в ранней стадии болезни или в будущем, использовать новые антифиброзные терапии, которые в настоящее время проходят клинические исследования (41-43).