Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 277(2):L240-L250

Регулирование взаимодействия альвеолярных макрофагов и T-клеток в течение Th1 саркоидного воспалительного процесса

Carlo Agostini, Livio Trentin, Alessandra Perin, Monica Facco, Marta Siviero, Francesco Piazza, Umberto Basso, Fausto Adami, Renato Zambello, and Gianpietro Semenzato
Department of Clinical and Experimental Medicine, Padua Hospital, Padua University School of Medicine, 35128 Padua, Italy

Реферат

Функция антигенпрезентирующих клеток зависит от присутствия множества костимулирующих молекул, включая членов семейства B7 (CD80 и CD86) и CD5 колиганд CD72. Цель этого исследования состояла в том, чтобы оценить пути регуляции антигенпрезентирующих T-клеток в легком у пациентов с типичной Th1 реакцией, то есть, саркоидозом. Альвеолярные макрофаги (AMs) у пациентов с саркоидозом с CD4 альвеолитом экспрессируют интерлейкин -15. Лимфоциты, производящие T-клеточный альвеолит экспрессируют Th1 цитокины (интерферон - гамма и/или IL-2) и несут высокие уровни CD5 и CD28, но не CD152 молекул. При in vitro стимуляции AMs Th1 цитокинами (IL-15 и IFN-gamma) наблюдалось увеличение экспрессии молекул CD80 и CD86. Однако, стимуляция IL-15 вызвала экспрессию Th1 цитокинов IFN-gamma и CD28 у саркоидных T-клеток, предполагая важную роль этого макрофагального цитокина в активации саркоидных T-клеток. Гипотеза, что молекулы CD80 и CD86 регулируют саркоидный T-клеточый ответ, была подтверждена доказательствами, что AMs вызвали сильную пролиферацию T-клеток, которая замедлялась при обработке CD80 и CD86 моноклональными антителами. Чтобы объяснять эти данные, было предположено, что местное производство цитокинов наделяет AMs дополнительными свойствами, которые вносят вклад в развитие саркоидного Т-клеточного альвеолита.

Введение

Альвеолярные макрофаги (AMs) - представители мононуклеарной фагоцитарной системы в легком и стратегически расположены на внутренней поверхности системы воздух-легочная ткань, регулярно подвергаемой воздействию ингаляционных антигенов (19, 20). Хотя считается, что легочные макрофаги играют критическую роль в инициировании иммунных реакций в пределах легкого, AMs у здоровых индивидуумов фунционируют слабее акцессорных клеток (ACs) при презентации антигенов. Они используют различные механизмы, чтобы ингибировать интраальвеолярные T-клеточные иммунные реакции, включая ингибирование секреции трансформирующего фактора роста бета и низкую экспрессию рецепторов, которые обеспечивают передачу костимуляторных сигналов легочным T-клеткам, включая CD80 (9, 30).

Хотя нормальные AMs имеют недостаточную акцессорную функцию, у пациентов с аллергическими реакциями, связанными с саркоидозом, они действуют как профессиональные антигенпрезентирующме клетки (APCs) при T-клеточных иммунных реакциях (16, 32). Саркоидоз характеризован персистирующим накоплением CD4+ Th1 клеток в легком (22, 23), и это позволило предположить, что взаимодействие между AMs и Т-клетками является критическим фактором в локальной активации и пролиферации T-клеток, ведущим к развитию CD4+ T-клеточного альвеолита (3, 32). Взаимодействие T-клеток зависит от присутствия множества костимулирующмих молекул, включая членов семейства B7 (CD80 и CD86), некоторых других молекул - членов суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNF) (CD40 и CD27) и CD5 колиганда CD72 (11, 26, 28). Хотя имеются фенотипические данные относительно экспрессии членов семейств рецептора TNF и B7 макрофагами (5, 24), относительно молекул, которые регулируют B7 и CD72 в течение саркоидного воспалительного процесса, известно немного.

В этом исследовании мы оценили роль CD72/CD5 и CD80-CD86/CD28-CD152 путей в развитии и поддержании T-клеточного альвеолита при саркоидозе. Наши результаты демонстрируют, что саркоидные AMs увеличивают экспрессию этих молекул, что обеспечивает макрофаги акцессорной функцией для активации и пролиферации T-клеток. Интерлейкин -15 и интерферон-гамма, вероятно, участвуют в событиях, ведущих к увеличенной экспрессии костимуляторных молекул.

Материалы и методы

Был исследован 21 пациент с саркоидозом (7 мужчин и 14 женщин; средний возраст 35.4 ± 7.1 лет). Во всех случаях диагноз был установлен после биопсии легких или лимфатических узлов, при демонстрации неказеозных эпителиоидных гранулем без признаков наличия неорганического материала, способного вызывать гранулематозные болезни. У каждого пациента был исследован бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ).

Наличие активной болезни было определено на основе следующих характеристик: 1) лимфоцитарный альвеолит (> 30*10³ lymphocytes/ml), 2) позитивная сцинтиграфия с галлием 67, и 3) отношение CD4/CD8 > 5.0. Кроме анализа БАЛ, оценка активности болезни включала клинические особенности, рентгенограмму, тесты функции легкого, компьютерную томографию с высоким разрешением и обычные исследования крови.

Аналих БАЛ был получен у 6 пациентов с предварительно диагностированным легочным саркоидозом, у которых анализ БАЛ был повторен в последующий период. Все эти пациенты имели неактивную фазу болезни, так как они имели нормальную функцию легкого, нормальное число клеток БАЛ, негативные результаты сцинтиграфии с галлием 67 и никаких клинических признаков острого заболевания. У 4 из 5 этих пациентов ранне проводилась стероидная терапия (преднизон, 1 милиграмм/кг/ в день), но ни один пациент не получал иммуносупрессивную терапию менее чем за 6 месяцев до проведения анализа БАЛ.

12 здоровых взрослых индивидуумов были отобраны в группу контроля (6 мужчин и 6 женщин; средний возраст 30.2 ± 6.1 лет; 4 некурящих здоровых мужчины и 8 пациентов, имевших жалобы на кашель без болезни легкого). Они имели нормальную физикальную экспертизу, рентгенограмму, функцию легкого и число клеток в БАЛ.

Результаты

Вследствие увеличения абсолютного числа CD4+ T-клеток, отношение CD4/CD8 в БАЛ было значительно увеличено у пациентов с активной болезнью по сравнению с пациентами с бездействующей болезнью и группой контроля. Как было ранее сообщено (2), > 98 % Т-лимфоцитов БАЛ пациентов с саркоидозом, были CD4+/CD45R0+ T клетками.

Экспрессия костимулирующих молекул нормальными клетками БАЛ

Как первый шаг в исследовании роли корецепторных систем в местной иммунной реакции, мы оценили экспрессию поверхностных рецепторов AMs и лимфоцитов БАЛ, изолированных у здоровых индивидуумов. У всех здоровых индивидуумов, полное число клеток БАЛ располагалось в диапазоне от 8.5 до 12*10⁶; < 10 % клеток БАЛ были лимфоцитами. Хелперы и супрессоры имели приблизительно такую же пропорцию, как в периферической крови (отношение CD4/CD8 1.95 ± 0.44).

Легочные макрофаги здоровых индивидуумов не демонстрировали экспрессии IL-15, TNF-beta и IFN-gamma. T-клетки нормальной жидкости БАЛ показали сильную экспрессию CD5. Нормальные T-клетки БАЛ не экспрессировали CD5 лиганд CD72 или CD152; кроме того, они не экспрессировали эндоплазматические цитокины.

Саркоидные макрофаги коэкспрессируют костимулирующие молекулы, участвующие в запуске T-клеточной иммунной реакции

Альвеолит, характеризованный накоплением CD4 клеток, является критерием саркоидоза. AMs изолированные у пациентов с активным саркоидозом и T-клеточным альвеолитом показали сильную модуляцию CD72, CD80 и CD86 молекул и эндоплазматических цитокинов (IL-15 и TNF-beta) участвующих в запуске Т-клеточных иммунных реакций. Интересно, что у всех пациентов, CD86 молекулы были экспрессированы AMs с более высокой интенсивностью чем CD80 (P < 0.001). Саркоидные AMs коэкспрессируют высокие уровни маркеров, связанных с их состоянием активации (CD14, CD54 и CD58).

Саркоидные T-клетки демонстрируют Th1 профиль

Проточная цитометрия Т-лимфоцитов БАЛ показала, что саркоидные CD4+ T-клетки экспрессируют CD5 молекулы. Гистограммы для CD5 у пациентов с активным саркоидозом значительно смещены по сравнению с гистограммами здоровых индивидуумов и пациентов с бездействующей болезнью. Увеличенная экспрессия CD28 была связана с увеличенной плотностью поверхностных активационных антигенов, включая CD69, CD103 и HLA-DR класса II с Th1 профилем цитокинов. Фактически, T-клетки пациентов с активной болезнью демонстрируют Th1 поляризацию иммунной реакции, так как они экспрессировали эндоплазматический IL-2 и IFN-gamma, но не IL-4. Менее 5 % T-клеток пациентов с бездействующей болезнью показали клеточный IL-2, IFN-gamma или IL-4.

Макрофагальные цитокины увеличивают экспрессию молекул семейства B7 на саркоидных макрофагах

Поскольку цитокины способны регулировать экспрессии B7, что ведет к активации APC, мы исследовали, увеличивали ли цитокины, экспрессированые легочными клетками, экспрессию молекул, участвующих во взаимодействии APC-T-клетки. В эксперименте, мы оценили, модулируют ли макрофагальные (то есть, IL-15 и TNF-beta) и Т-клеточные (IL-2 и IFN-gamma) цитокины экспрессию CD72, CD80 и CD86 лигандов на AMs у 5 пациентов с активным саркоидозом.

Эксперименты показали, что после 24-36 ч культивирования, саркоидные AMs частично теряют экспрессию CD80, CD86 и CD72. Фактически, MFI CD80 + и CD86 + AMs уменьшились, если они поддерживались в среде без стимуляции цитокинами (CD80 MFI 72.4 ± 10.1 и 23.2 ± 6.6 и CD86 MFI 161.5 ± 30.3 и 35.9 ± 12.2 в начале и через 24 ч, соответственно); кроме того, в отсутствии стимуляции, эндоплазматическая экспрессия цитокинов AMs прогрессивно снижается.

Прогрессирующая потеря состояния активации саркоидных AMs полностью изменяется инкубацией с цитокинами, так как воздействие IFN-gamma и IL-15 повторно вызвает экспрессию молекул B7. После рестимуляции IL-15, саркоидные AMs повторно реэкспрессируют увеличенные уровни CD80 (MFI 81.5 ± 12.9 после рестимуляции IL-15; P < 0.001) и CD86 (MFI 151.7 ± 99.7 после рестимуляции IL-15; P < 0.001). IFN-gamma также вызвал увеличение экспрессии CD80 (67.2 ± 11.0; P < 0.001) и CD86 (140.7 ± 40.3; P < 0.001). Наоборот, рестимуляция с TNF-beta и IL-2 не модифицировала экспрессию CD80 (26.3 ± 10.6 и 31.3 ± 7.4, соответственно) и CD86 (22.1 ± 9.1 и 41.2 ± 11.3, соответственно). Хотя IFN-gamma и IL-15 повторно вызвали экспрессию молекул B7 на саркоидных макрофагах, инкубация не стимулировала CD80, CD86 и CD72 экспрессию на нормальных макрофагах, изолированных у 5 здоровых индивидуумов. В частности стимуляция IL-15 и IFN-gamma не модифицировала экспрессию CD80 (31.2 ± 11.1 и 33.4 ± 6.8, соответственно), CD86 (29.7 ± 8.9 и 33.3 ± 11.3, соответственно) и CD72 (42.3 ± 7.7 и 41.4 ± 8.4, соответственно).

В третьей группе экспериментов, мы оценили, могут ли антитела к цитокинам редуцировать экспрессию CD80 и CD86 на саркоидных AMs. Макрофаги показали значительное уменьшение экспрессии CD80 и CD86 колигандов после инкубации; однако, антитела к IL-15 и IFN- gamma не производили дальнейшего уменьшения интенсивности экспрессии этих костимулирующих молекул.

IL-15 и IFN-gamma модулируют экспрессию CD28 на саркоидных T-клетках

После культивирования в течение 24 ч, экспрессия CD28, частично уменьшилась (CD28 MFI 51.6 ± 8.8 и 27.1 ± 7.3 в начале и через 24 ч, соответственно). Когда T клетки повторно стимулировались в течение 12 ч с IL-15 и IFN-gamma, цитокины были способны повторно стимулировать экспрессию CD28 молекул на саркоидных T клетках (MFI 41.2 ± 6.1 и 37.2 ± 6.3, соответственно; P < 0.001). У 3 из 5 пациентов, IL-2 увеличил экспрессию CD28, принимая во внимание, что TNF-beta не модифицировал изменение B7 лиганда. Кроме того, стимуляция IL-2, IFN-gamma, IL-15, и TNF-beta не модулировали экспрессию CD154 на саркоидных T-клетках. После добавления anti-IFN-gamma и Anti-IL-15, экспрессия CD28 уменьшилась.

B7 и CD72 молекулы, экспрессированные саркоидными макрофагами, регулируют пролиферативную активность T-клеток

Вышеупомянутые результаты предполагают, что макрофагальные цитокины обеспечивают непрекращающийся цикл воспаления в легком, где IFN-gamma и IL-15 поддерживают экспрессию костимулирующих молекул на APCs, участвующих в активации T-клеток. IL-15, в свою очередь, стимулирует пролиферацию саркоидных T-клеток (1). Возможность, что индуцированная цитокинами экспрессия молекул B7 может усиливать антигенпрезентирующую способность AMs, была исследована in vitro, где митотическая активность очищенных аллогенных T-клеток была исследована в присутствии саркоидных макрофагов. Чистота популяции T-лимфоцитов, используемых в этом исследовании превысила 99 %, фактически без остаточных моноцитов / макрофагов. Очищенные T-клетки не пролиферировали, когда стимулировались конканавалином, если дополнительные клетки не были добавлены. Однако, саркоидные AMs вызвали пролиферацию очищенных T-клеток в присутствии митогена (13, 30).

Добавление моноклональных антител anti-CD72, anti-CD80, anti-CD86 и Anti-IL-15 замедляло пролиферацию T-клеток. Помимо подтверждения функциональной важности экспрессии IL-15 AMs (3), эти данные указывают на важную роль CD80-CD86/CD28 в поддержании иммунной реакции у пациентов с активным саркоидозом.

Обсуждение

В этом исследовании мы продемонстрировали, что макрофаги и T-клетки, изолированные из легких пациентов с саркоидозом являются преактивированными, что указывает на активацию CD72/CD5 и CD80-CD86/CD28 костимулирующих систем, которые, в свою очередь, регулируют пролиферацию саркоидных T-клеток. Кроме того, легочные клетки экспрессировали высокие уровни цитокинов, что предполагает их важную роль в управляемой цитокинами модуляции CD72/CD5 и CD80-CD86/CD28 и компартментализации T-клеточного ответа в легких.

Активация T-клеток требует по крайней мере двух мембранных сигналов. Первый сигнал производится T-клеточными рецепторами после контакта с антигеном. Кроме того, T-клетки требуют дополнительных костимулирующих сигналов, включая семейство B7 и систему CD72/CD5 (17). Члены семейства B7 принадлежат суперсемейству гена иммуноглобулина; при физиологических состояниях их экспрессия ограничена клетками, которые могут функционировать как APC и экспрессия B7 была обнаружена в здоровых легких. Паттерн экспрессии CD80 и CD86 легочных макрофагов пациентов с интерстициальной болезнью легкого (CD86 молекулы были обнаружены на AMS с более высокой интенсивностью чем CD80), совместимы с паттерном у нормальных APCs, так как ранее было показано, что CD80 обычно имеют более низкие уровни экспрессии, чем CD86 (13, 17). Вероятно, экспрессия CD80 и CD86 может позволять действовать AMs как APCs при стимуляции местного Th1 ответа на антигены в других органах (34). Фактически, подобный паттерн экспрессии B7 происходит в кишечнике, при инфекции Helicobacter pylori в слизистой желудка, что характеризуется увеличением числа эпителиальных T-клеток в желудке (34). Кроме того, сообщалось об увеличенной экспрессии молекул B7 на дендритных клетках у пациентов с T- клеточными болезнями кожи (21) и у APCs, изолированных из синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом (33).

Наши данные также подчеркивают уместность CD5/CD72 пути в генерации ответа T-клеток, происходящего в легком при саркоидозе. CD5- 67-kDa тип I трансмембранный гликопротеид физически и функционально вместе с комплексом T-клеточный рецептор - CD3 трансдуктор участвует в пролиферации T-клеток. Фактически, его запуск, помимо стимулирования секреции IL-2 и рецепторов IL-2, дает сигнал для пролиферации T-клеток (27). Хотя известно, что колиганд CD5 CD72 экспрессируется субпопуляциями B-клеток с антиген-презентирующими свойствами (10), роль этой костимулирующей молекулы менее ясна. В нашем исследовании AMs пациентов с саркоидозом сверхэкспрессировали CD5 лиганд CD72 и инкубация с Anti-CD72 MAb привела к частичной потере макрофагами акцессорных свойств. По нашим данным, это первая демонстрация увеличенной экспрессии CD72 молекул клетками, участвующих в местной иммунной реакции в слизистой. На основании увеличения экспрессии CD72 на AMs, может быть предположено, что эта молекула позволяет макрофагам взаимодействовать с местными CD5+ T-клетками. Отсутствие B7 и CD72 на нормальных AMs может частично объяснять их неспособность отвечать на антигены. В частности, так как слизистая дыхательных путой представляет самую большую внутреннюю поверхность между внешней и внутренней средой и ежедневно подвергается воздействию более 10,000 литров вдыхаемого воздуха, вероятно, что недостаток этих молекул может быть важен в индукции местных механизмов толерантности.

Регулирование экспрессии костимуляторных молекул APCs и T-клетками управляется несколькими цитокинами. Молекулы семейства B7 экспрессированы на моноцитах после активации IFN-gamma (12, 13), принимая во внимание, что IL-10 блокирует CD80 и CD86 антигены на перитонеальных макрофагах и уменьшает экспрессию CD86, но не CD80 на дендритных клетках (8). Однако, экспрессия CD28 и CD152 увеличивается после активации T-клеток (18, 31). В свою очередь, CD28 увеличивает производство нескольких цитокинов, включая IL-2, IL-4, TNF-beta и IFN-gamma (29). Дифференцирование Th1 и Th2 субпопуляций T-клеток, как считается, зависит от CD28. В частности имеются данные, предполагающие, что в отсутствии сигнала CD28, исходные T-клетки смещены к Th1 фенотипу (28).

Взаимосвязь между цитокинами и костимуляторами подтверждена нашими данными, потому что экзогенный IL-15 и IFN-gamma увеличивали экспрессию CD80 и, в частности, экспрессия CD86 на макрофагах БАЛ и саркоидных CD4+ T-клетках имела Th1 профиль (6, 22). Интересно, что хотя IFN-gamma и, в частности, IL-15 повторно вызвал экспрессию молекул B7 на саркоидных макрофагах, инкубация с цитокинами не модифицировала экспрессию нормальных AMs. Чтобы объяснить эти различия, может быть предложено несколько гипотез: 1) саркоидные макрофаги по своей природе отличаются от нормальных макрофагов, 2) необходимо присутствие неизвестного антигена (антигенов), который вызывает саркоидный воспалительный процесс, чтобы стимулировать IL-15-зависимую экспрессию CD80 и CD86, и 3) моноциты (то есть, мононуклеарные клетки, которые производят саркоидный альвеолит (2)), но не дифференцированные макрофаги (как резидентные AMs в легком здоровых индивидуумов) отвечают на стимуляцию IL-15 с увеличением экспрессией акцессорных молекул. В наших лабораториях происходит проверка этих возможностей и оценка важности других цитокинов в регулировании костимулирующих путей. В частности, так как IL-12 синергистически взаимодействует с B7-CD28 при стимулировании пролиферации и производства цитокинов T-клетками (14) и IL-12 активно производится в легком при саркоидозе (21), мы планируем оценить, могут ли механизмы взаимодействя между IL-12 и IL-15 участвовать в поддержании саркоидного воспалительного ответа. Кроме того, необходимы дальнейшие исследования, чтобы сравнить паттерн цитокинов, произведенных AMs пациентов с саркоидозом с паттерном типичного Th2 ответа в легком, например, у пациентов с астмой. Этот сравнительный анализ будет критическим в определении, ведут ли изменения экспрессии цитокинов и/или костимуляторных молекул к селективному развитию Th1 и Th2 иммунных реакций и, следовательно, развитию гранулем в легком (15).

Интересно, что CD152 никогда не экспрессируется легочными T-клетками. Недавние данные (7, 25) поддерживают роль CD152 как регуляторной молекулы в активации T-клеток или конкурирующей с CD28 или стимулирующей апоптоз. Agostini с коллегами (5) и другие исследователи (24) недавно продемонстрировали, что в легких пациентов с саркоидозом происходит дисрегуляция экспрессии членов суперсемейства рецептора TNF и что патологическая экспрессия этих молекул может влиять на персистироование местной иммунной реакции в пределах легкого (5). Исследование экспрессии CD152 T-клетками в течение различных фаз саркоидного воспалительного процесса в различных стадиях болезни, могло бы помочь в определении роли этой молекулы. Лучше понимание связи между суперсемейством рецептора TNF и CD80-CD86/CD28-CD152 в легких пациентов с различными интерстициальными болезнями легкого, как ожидается, позволит понять факторы, управляющие иммунной реакцией в пределах респираторного тракта.