Journal of Clinical Microbiology, September 2005, p. 4858-4861, Vol. 43, No. 9

Описание Mycobacterium tuberculosis Complex у Греческих пациентов с саркоидозом с помошью сполиготипирования

M. Gazouli, J. Ikonomopoulos,A. Koundourakis, M. Bartos, I. Pavlik, P. Overduin, K. Kremer, V. Gorgoulis, and C. Kittas
Department of Histology-Embryology, School of Medicine, University of Athens, Greece, Department of Anatomy-Physiology, Agricultural University, Athens, Greece, Veterinary Research Institute, Brno, Czech Republic, Diagnostic Laboratory for Infectious Disease and Perinatal Screening, National Institute of Public Health and the Environment, Bilthoven, The Netherlands

Реферат

38 изолятов полученных у Греческих пациентов с саркоидозом и 31 изолят полученных у пациентов с туберкулезом, были проанализированы с помощью сполиготипирования. 50 % изолятов пациентов с саркоидозом и 16.13 % изолятов пациентов с туберкулезом имели уникальный паттерн, принимая во внимание, что остальные изоляты принадлежали к 7 известным сполиготипам. Интересно, что половина сполиготипов пациентов с саркоидозом не была похожа на сполиготипы пациентов с туберкулезом.

Введение

Саркоидоз - гранулематозная болезнь неизвестной причины, которая поражает различные органы. Иммунные гранулемы при саркоидозе, верооятно формируются в результате иммунологического ответа на антигенный триггер. Предполагалось, что инфекционные агенты, включая микобактерии, пропионибактерии, паразиты и грибы, могут являться вероятными триггерами (то есть действуют не как инфекция) у наследственно предрасположенных индивидуумов, что ведет к саркоидному гранулематозному ответу (2). Неинфекционные агенты, такие как бериллий, цирконий и алюминий, также могут вызывать гранулематозный ответ (2). Большинство исследований инфекционной причины саркоидоза были сосредоточены на микобактериях (8), но убедительных доказательств связи между саркоидозом и микобактериальными агентами получено не было. Недавно, на основани амплификации IS6110, MPB64 и mtp-40 с помощью ПЦР, мы сообщили о присутствии Mycobacterium tuberculosis Complex у 71.7 % Греческих пациентов с саркоидозом (4). Однако, используемые методы не позволили произвести детальное дифференцирование Mycobacterium tuberculosis Complex в изолятах.

Сполиготипирование - метод типирования, который основан на полиморфизме ДНК Mycobacterium tuberculosis Complex и является ценным инструментом при исследовании эпидемиологии туберкулеза и возможно саркоидоза. В основе метода сполиготипирования лежит полиморфизм локуса DR. Этот локус содержит различное число коротких прямых повторов длиной 35 до 41 пар оснований, разделенных уникальными последовательностями, называемыми спейсерами. Штаммы Mycobacterium tuberculosis Complex различаются по числу DR и, соответственно, по числу спейсеров и могут быть дифференцированы по этому признаку. Так как структура DR высоко консервативна для различных штаммов Mycobacterium tuberculosis Complex, то очевидно, что каждая копия DR в составе локуса может использоваться в качестве мишени при ПЦР. Различия в получаемых при амплификации наборах спейсеров дают разные картины гибридизации с набором синтетических олигонуклеотидов, ковалентно пришитых к нитроцеллюлозной мембране. Порядок расположения синтетических спейсеров на мембране соответствует их расположению в геноме. Таким образом, в результате гибридизации образуется характерный для каждого штамма паттерн гибридизации - сполиготип. Так как сполиготипирование основано на ПЦР, оно может быть выполнено непосредственно с Mycobacterium tuberculosis Complex и с нежизнеспособными огранизмами в сохраненных в парафине тканях (13).

Цель нашего исследования состояла в том, чтобы определить молекулярную эпидемиологию саркоидоза в Греции с помощью сполиготипирования. Мы хотели определить, имеются ли в изолятах Mycobacterium tuberculosis Complex пациентов с саркоидозом сполиготипы, которые являются обычными в мире и подобными изолированным у Греческих пациентов с туберкулезом или пациенты с саркоидозом имеют специфические сполиготипы.

Методы

33 зафиксированных в формалине и залитых парафином образцов ткани (ткани легкого и лимфатического узла) и 7 образцов бронхоальвеолярного лаважа, которые ранее были определенны как IS6110-положительные (4), были подвергнуты структурно-групповому анализу. Кроме того, зафиксированные в формалине и залитые парафином образцы ткани легкого 32 Греческих пациентов с туберкулезом, были проанализированы в качестве контроля. Извлечение ДНК было проведено согласно ранее описанной методике (4). ДНК была подвегнута ПЦР (ISOGEN Bioscience, Maarsen, Нидерланды) согласно инструкции изготовителя. Результаты сполиготипирования были сравнены с базой данных сполиготипов spoIDB3.0 (11). Во время проведения исследования, база данных spoIDB3.0 содержала 13,008 паттернов из более 90 стран (11). Считалось, что изолят был имеет известный тип, если сполиготип был найден в изолятах, полученных у двух или более пациентов в мире. Если ни один сполиготип не был идентифицирован в базе данных, изолят был определен как уникальный. Все идентифицированные сполиготипы были внесены в базу данных сполиготипов (http://www.pasteur-guadeloupe.fr/tb/spoldb3).

Результаты

38 образцов ткани пациентов с саркоидозом и 31 образцец ткани пациентов с туберкулезом имели неповрежденную ДНК, пригодную для сполиготипирования. В 38 образцах ткани пациентов с саркоидозом, было идентифицировано 24 различных сполиготипа и 9 сполиготипов были идентифицированы у пациентов с туберкулезом. 19 (50 %) изолятов пациентов с саркоидозом имели уникальный паттерн, принимая во внимание, что 19 (50 %) изолятов принадлежали к 6 известным типам, уже внесенным в spoIDB3.0. Пять (16.13 %) изолятов пациентов с туберкулезом имели уникальный паттерн, принимая во внимание, что 26 (83.87 %) изолятов принадлежали к 6 известным типам, уже внесенным в spoIDB3.0. Все пациенты родились и жили в Греции и эпидемиологически не были связаны. 18 изолятов пациентов с саркоидозом демонстрировали подобный паттерн с пациентами с туберкулезом. Один сполиготип (тип 53), наблюдался в 28.95 % изолятов пациентов с саркоидозом и 35.48 % изолятов пациентов с туберкулезом. Связи между специфическими сполиготипами и происхождением исследованной ткани не наблюдалась.

Обсуждение

Это первое сообщение, описывающее молекулярные характеристики Mycobacterium tuberculosis Complex у пациентов с саркоидозом и туберкулезом в Греции. Почти 34.78 % сполиготипов были специфическими для Греции и 50 % пациентов с саркоидозом и 16.13 % пациентов с туберкулезом были инфицированы изолятом Mycobacterium tuberculosis Complex, имеющим сполиготип, который ранее не был представлен в глобальной базе данных сполиготипов.

Приблизительно половина сполиготипов, полученных у Греческих пациентов, относятся к ранее идентифицированным сполиготипам. Значительная часть (31.88 %) принадлежит к типу 53. Тип 53, вместе с типом 50, составляют 11.8 % изолятов Mycobacterium tuberculosis Complex в базе данных сполиготипов, и возможно, были распространенены в Европе в течение нескольких столетий (3).

Исследуя изоляты Mycobacterium tuberculosis Complex у пациентов с саркоидозом, мы обнаружили, что половина из них имела уникальные сполиготипы. Интересно, что 50 % изолятов пациентов с саркоидозом не походила на сполиготипы изолятов пациентов с туберкулезом, большинство из которых имело извесные сполиготипы. Эти результаты поддерживают гипотезу, что члены семейства Mycobacterium tuberculosis Complex могут вносить вклад в развитие саркоидоза. Однако, необходимы дальнейшие исследования чтобы определить, являются ли эти сполиготипы специфическими для саркоидоза, специфическими для Греции и насколько широко они распространенны в Греции. Пока мы далеки от утверждения, что саркоидоз связан с уникальными сполиготипами Mycobacterium tuberculosis Complex.

Один из наиболее широко распространенных видов Mycobacterium tuberculosis Complex - так называемый Пекинский тип, был связан со вспышками туберкулеза во всем мире (1, 6, 7, 9, 10, 12). Хотя Греция в последние несколько лет принимала иммигрантов из России, Китая, Эстонии и Балканских стран, Пекинский генотип Mycobacterium tuberculosis не наблюдался. Кроме того, сполиготипы, характерные для Австралии, Франции, Великобритании, Италии, Нидерландов, Пакистана, Индии и Соединенным Штатов, наблюдались очень редко.

К сожалению, в Греции и в соседних странах, информация относительно молекулярной эпидемиологии туберкулеза и особенно саркоидоза, недоступна, что не позволяет провести классификацию и исследовать распространение этих сполиготипов. Анализ большего числа образцов возможно сможет обнаружить сполиготипы, специфически связанные с саркоидозом и проверить гипотезу относительно участия некоторых типов микобактерий в этиологии саркоидоза.