Chest. 2006;129:1584-1591.

Полиморфизмы гена трансформирующего фактора роста бета у пациентов с саркоидозом с и без фиброза

Adrian Kruit, MSc; Jan C. Grutters, MD, PhD; Henk J. T. Ruven, PhD; Coline H. M. van Moorsel, PhD; Ralf Weiskirchen, PhD; Senait Mengsteab, BSc and Jules M. M. van den Bosch, MD, PhD, FCCP
From the Heart Lung Centre Utrecht, St. Antonius Hospital, Departments of Pulmonology, and Clinical Chemistry, Nieuwegein, the Netherlands; and Institute of Clinical Chemistry and Pathobiochemistry, RWTH-University Hospital, Aachen, Germany.

Резюме

Цель исследования: легочный фиброз развивается приблизительно у 25 % пациентов с хроническим саркоидозом. Трансформирующий фактор роста бета 1 (TGF-beta 1) играет важную роль в фиброзе. В последние годы были получены данные о роли TGF-beta 2 и TGF-beta 3 в этом процессе. Мы исследовали, могут ли полиморфизмы единичного нуклеотида (SNPs) гена TGF-beta 1, TGF-beta 2 и TGF-beta 3, вносить вклад в легочный фиброз у пациентов с саркоидозом. Место проведения: клиника в Нидерландах. Дизайн: были исследованы пять SNPs гена TGF-beta. Пациенты и группа контроля: пациенты с острым / самоограниченным саркоидозом (n = 50), синдромом Лёфгрена (n = 46), хронической болезнью с фиброзом (n = 24) и без фиброза (n = 34) были оценены в течение 4-летнего периода. В группу контроля были включены 315 индивидуумов. Результаты: частота аллеля TGF-beta 3 4875 была значительно выше у пациентов с фиброзом (частота носителей 0.29), чем у пациентов с острым / самоограниченным (0.06) и хроническим (0.03) саркоидозом (p = 0.01; OR, 7.9). Частота аллеля TGF-beta 3 17369 C была значительно выше у пациентов с фиброзом (0.29) по сравнению с острым / самоограниченным (0.08) и хроническим (0.06) саркоидозом (p = 0.05; OR, 5.1). Частота аллеля TGF-beta 3 15101 G была более низкой у пациентов с фиброзом (0.79) по сравнению с острым / самоограниченным (0.94) и хроническим (1.00) саркоидозом (p = 0.02; OR, 0.15). Аллель TGF-beta 2 59941 G более часто наблюдался у пациентов с фиброзом (0.62) по сравнению с пациентами с острым / самоограниченным (0.41) и хроническим саркоидозом (0.28) [p = 0.04; OR, 2.9]. Полиморфизмы гена TGF-beta 1 не были связаны с фиброзом. Заключение: наше исследование предположило значение вариантов гена TGF-beta 3 в склонности к развитию легочного фиброза у пациентов с саркоидозом.

Введение

Саркоидоз - системная болезнь неизвестной причины, которая характеризуется формированием неказеозных гранулем в одном или нескольких органах (1). Приблизительно у 90 % пациентов с саркоидозом развивается легочная болезнь (2). Хотя паренхиматозные ненормальности часто разрешаются спонтанно, легочный фиброз развивается приблизительно у 20-25 % пациентов (3). Легочный фиброз характеризуется непропорциональным увеличением производства внеклеточного матрикса легочными фибробластами (45). Изоформа TGF-beta 1 семейства TGF-beta была интенсивно исследована при фиброзных болезнях легкого, при саркоидозе рентгенографической стадии IV (6, 7) и при идиопатическом легочном фиброзе (8, 9).

В отличие от TGF-beta 1, изоформы TGF-beta 2 и TGF-beta 3 не привлекали к себе должного внимания. Паттерн экспрессии TGF-beta 3 в легком предлагает, что дисбаланс производства TGF-beta 1 и TGF-beta 3 является ключевым в развитии повреждения ткани при фиброзе (10, 11, 12).

Полиморфизмы генов, кодирующих все три изоформы TGF-beta, были идентифицированы и связаны с функциональными различиями или различиями экспрессии. SNPs гена TGF-beta 1 были обнаружены в кодоне 10 (Leu10Pro) и кодоне 25 (Arg25Pro). Оба полиморфизма были связаны с индивидуальными раличиями производства TGF-beta 1 (13). Они, как и другие полиморфизмы TGF-beta 1, были связаны с увеличенным риском легочного фиброза (14, 15).

Полиморфизмы гена TGF-beta 2 и TGF-beta 3, были связаны с кожным фиброзом при системной склеродермии (16), что указывало на генетический базис патогенеза этой фиброзной болезни.

Исследований полиморфизмов генов семейства TGF-beta было проведено мало. Полиморфизмы Leu10Pro и Arg25Pro гена TGF-beta были оценены в отношении прогресса саркоидоза у Японских (17) и белых пациентов (18). Однако, никаких связей не было найдено между полиморфизмами и прогрессом болезни, восприимчивостью к саркоидозу или серьезностью болезни.

Мы выдвинули гипотезу, что TGF-beta играет важную роль в развитии легочного фиброза при саркоидозе и что варианты гена TGF-beta 1, TGF-beta 2 и TGF-beta 3 лежат в основе предрасположенности к развитию фиброза у пациентов с саркоидозом. Поэтому, мы определили различия частот SNPs и гаплотипов для всех изоформ TGF-beta 1, TGF-beta 2 и TGF-beta 3 у пациентов с фиброзом и без фибоза в течение 4-летнего периода.

Пациенты

В исследование были включены 145 Голландских белых пациентов, у которых диагноз саркоидоз был установлен в период 1965-1999 г. (88 мужчин и 66 женщин; средний возраст при постановке диагноза 36.5 ± 10.4 лет; диапазон от 17 до 71 года). Диагноз саркоидоз был установлен согласно критериев ATS/ERS/WASOG (19). У 46 пациентов диагноз был установлен без биопсии, поскольку эти пациенты имели классический синдром Лёфгена, лихорадку, узловатую эритему, артралгию и двустороннюю внутригрудную лимфаденопатию. Комитет по этике St. Antonius Hospital одобрил проведение исследования и все пациенты дали письменное информированное согласие.

Рентгенограммы были оценены двумя специалистами по диффузным болезням легкого. Для определения серьезности болезни, использовалась стандартная система рентгенографических стадий саркоидоза, предложенная Scadding (19). Рентгенографические данные были доступны у 101 пациента с саркоидозом. Один пациент имел стадию 0, 44 пациента имели стадию I, 28 пациентов стадию II, 25 пациентов стадию III и 3 пациента стадию IV. Эволюция рентгенографической болезни в течение 4-летнего периода наблюдения была категоризирована следующим образом: острая / самоограниченная болезнь (нормализация или улучшение к стадии I, n = 50); хроническая болезнь (персистирующая стадия II/III или прогресс к этой стадии, n = 34); и фиброз (устойчивая стадия IV или прогресс к этой стадии, n = 24). В последней группе, 7 пациентов с рентгенографической стадией IV имели саркоидоз, диагностированный вне нашей клиники. Результаты КТВР были доступны для 16 пациентов со стадией IV саркоидоза. У этих пациентов, наблюдались три основных паттерна фиброза (линейный, сотовый и деформация бронхов), согласно классификации Abehsera (20). В частности, 11 пациентов имели линейный паттерн различной степени, от минимального до серьезного, (6 пациентов с сопутствующей деформацией бронхов, от умеренной до серьезной; 4 пациента имели серьезный линейный паттерн с серьезной деформацией бронхов; 1 пациент имел серьезный сотовый, серьезный линейный паттерн и серьезную деформацию бронхов).

Синдром Лёфгрена был диагностирован у 46 пациентов. Из этой группы, у 45 пациентов проводилось рентгенографическое наблюдение. Рентгенограммы у этих пациентов нормализовались через 2 - 4 года после постановки диагноза, кроме одного пациента, у которого рентгенографическая стадия I сохранилась после 4 лет наблюдения. По техническим причинам, 4 пациента группы с острой / самоограниченной болезнью, 3 пациента с хронической болезнью и 2 пациента с синдромом Лёфгрена не могли быть генотипированы для TGF-beta 2. Группа контроля включала 315 здоровых, Голландских белых служащих St. Antonius Hospital (118 мужчин и 197 женщин; средний возраст 39.0 ± 11.4 лет; диапазон от 18 до 68 лет).

Результаты

Распределение частот аллелей и генотипов TGF-beta 1, TGF-beta 2 и TGF-beta 3 у пациентов с саркоидозом и в группе контроля не отклонялись от закона Харди-Вайнберга. Частоты полиморфизмов не отличались между леченными и не леченными, между курящими и не курящими и между пациентами с различными рентгенографическими стадиями при постановке диагноза. Частота аллеля С полиморфизма TGF-beta 1 28 T/C была более низкой у пациентов с синдромом Лёфгрена (0.52) по сравнению с группой контроля (0.69), что было связано с увеличенной частотой генотипа TT (0.48) и уменьшенной частотой генотипа CT (0.35) по сравнению с группой контроля (генотип TT 0.31; генотип CT 0.51; p = 0.05; df = 2). У пациентов с фиброзом наблюдалась большая частота аллеля G (0.62) TGF-beta 2 полиморфизма 59941 A/G, по сравнению с пациентами с острым / самоограниченным (0.41) и хроническим саркоидозом (0.28) (p = 0.04; OR 2.9; доверительный интервал 95 % [CI], от 1.1 до 7.4). Кроме того, группа контроля имела распределение генотипа A/G полиморфизма TGF-beta 2 59941 A/G (0.33) и AA (0.64), отличные от распределения у пациентов с фиброзом, AG (0.58) и AA (0.38) [p = 0.03; df = 2].

Частота аллеля А полиморфизма TGF-beta 3 4875 G/A была значительно выше у пациентов с фиброзом, по сравнению с пациентами с острым / самоограниченным и хроническим саркоидозом, 0.29 против 0.06 и 0.03, соответственно (p = 0.002; OR 7.9; 95 % CI, от 2.1 до 30.9). Распределение частот полиморфизма TGF-beta 3 4875 G/A не различались между группой контроля и пациентами с фиброзом (p = 0.13; df = 2).

Для SNP TGF-beta 3 15101 G/A, наблюдалось большее количество гомозиготных AA пациентов (0.21) и меньшее количество гомозиготных GG пациентов (0.50) среди пациентов с фиброзом, по сравнению с острым / самоограниченным (AA 0.06; GG 0.60) и хроническим саркоидозом (AA 0, GG 0.59) (p = 0.017; df = 2). Кроме того, частота аллеля G SNP 15101 G/A была более низкой у пациентов с фиброзом (0.79) по сравнению с пациентами с острым / самоограниченным (0.94) и хроническим (1.00) саркоидозом (p = 0.02; OR 0.15; 95 % CI, от 1.6 до 32.3). По сравнению с группой контроля, частота аллеля G у пациентов с фиброзом была ниже (0.79 против 0.94; p = 0.016; OR 0.23; 95 % CI, от 0.08 до 0.71). Наконец, аллель C SNP TGF-beta 3 17369 T/C, наблюдался более часто у пациентов с фиброзом (0.29) по сравнению с острым / самоограниченным (0.08) и хроническим (0.06) саркоидозом (p = 0.01; OR 5.1; 95 % CI, от 1.6 до 17.7).

Гаплотипы были построены для всех генов TGF-beta для пяти полиморфных локусов в каждом гене. Распределение частот гаплотипов было оценено у пациентов с эволюцией рентгенографической болезни и в группе контроля. Все гаплотипы TGF-beta 1, TGF-beta 2 и TGF-beta 3 были одинаково распределены между пациентами с саркоидозом и в группе контроля, между пациентом с различной эволюцией рентгенографической болезни, статусом лечения или курения. Только гаплотип 4 TGF-beta 3 коррелировал с фиброзом. Этот гаплотип отличается от других заменой G на A в позиции 4875.

Мы также оценили влияние генотипа TGF-beta на параметры функции легкого IVC, FEV1 и DLco. Мультивариантный анализ был выполнен для данных в начале исследования, через 2 и через 4 года с учетом статуса курения и лечения. Курение имело небольшое, но статистически значимое влияние на DLco, но не на другие параметры функции легкого (p = 0.01). Ни один из исследованных SNP, ни один из гаплотипов, не были связаны с IVC, FEV1 или DLco.

Обсуждение

В этом исследовании, пациенты с легочным фиброзом имели иное распределение SNP гена TGF-beta 3 по сравнению с пациентами без легочного фиброза. SNP TGF-beta 3 4875 G/A и 17369 T/C - полиморфизмы, позволяющие предположить генетическое влияние TGF-beta 3 на предрасположенность к легочному фиброзу у пациентов с саркоидозом.

Полиморфизмы генов TGF-beta 1, TGF-beta 2 и TGF-beta 3 не вносят вклад в восприимчивость к саркоидозу, на что указывает подобное распределение частот полиморфизмов между пациентами с саркоидозом и группой контроля. Недавно были картированы два новых функциональных полиморфизма TGF-beta 2. Один из этих SNP, раположенный в экзоне 1, связан с заменой аминокислоты A на G в кодоне 91 (26). Наша группа пациентов была генотипирована для этого полиморфизма, но различий с группой контроля обнаружено не было.

Полиморфизм гена TGF-beta 2 59941 A/G, расположенный в интроне 2, был связан с существенным увеличеним частоты аллеля G у пациентов с фиброзом, по сравнению с пациентами без фиброза. Этот SNP нуждается в дальнейших исследованиях. Ранее сообщалось (16) о связи генов TGF-beta 2 и TGF-beta 3 со склеродермией. Наше исследование показало, что варианты гена TGF-beta 3 могут вносить вклад в развитие легочного фиброза у пациентов с саркоидозом, по крайней мере согласно рентгенографическим данным. За исключением полиморфизма TGF-beta 3 17282 A/G (27), ни один из SNPs TGF-beta 3, описанный в нашем исследовании, не был изучен в других исследованих. Таким образом, к предположениям относительно любых фенотипических изменений, которые могут быть вызваны полиморфизмами 4875 G/A и/или 17369 T/C, нужно относиться с осторожностью. Kim (27) обнаружил сильную связь между SNP 17282 A/G и синдромом расщелины неба у Корейцев. Этот полиморфизм не был связан с легочным фиброзом в нашей группе пациентов с саркоидозом, что говорит, что этот полиморфизм имеет различное влияние при различных болезнях или что при его исследовании необходимо учитывать расовые факторы.

Наблюдение, что ни один из связанных с фиброзом SNP, ни гаплотип 4, не имели существенного влияния на функцию легкого, не было неожиданным. Известно, что функция легкого не всегда коррелирует с рентгенографической стадией (28) и хотя пациенты с фиброзом в целом имеют значительное ухудшение функции легкого, по сравнению с пациентами без фиброза. Некоторые пациенты с фиброзом могут иметь нормальные уровни IVC и DLco (20). Вследствие этого, распределение частот полиморфизмов у пациентов с фиброзом, при сравнении с пациентами без фиброза согласно результатам рентгенографии, может плохо коррелировать с параметрами функции легкого, которые обычно связаны с фиброзом.

В отличие от TGF-beta 2 и TGF-beta 3, связи с полиморфизмами гена, кодирующего TGF-beta 1, обнаружено не было. Известно, что все, кроме одного SNP (20743 C/T), влияют на уровни экспрессии TGF-beta 1 (13, 29). На основани доступной литературы, описывающей влияние индивидуальных SNP на изменение экспрессии TGF-beta 1, каждый гаплотип, который был построен в нашем исследовании, будет иметь результирующее влияние на уровни экспрессии. Ни один из гаплотипов TGF-beta 1 не мог быть приписан различным фенотипам саркоидоза. Таким образом, в соответствии с предыдущими сообщениями (17, 18), отсутствие связи между гаплотипами и фенотипом болезни подразумевает, что генетически определяемые уровни TGF-beta 1 не позволяют предсказать исход болезни и не вносят вклад в восприимчивость к саркоидозу. Важно отметить, что отсутствие связи между вариантами TGF-beta 1 и развитием фиброза, пока не может быть окончательным. Для подтверждения отрицательного результата необходима существенно большая группа (n = 62, чтобы достичь статистической мощности 80 %) пациентов с легочным фиброзом.

Возможно, баланс между тремя изоформами TGF-beta может определять характер течения болезни. Изоформы TGF-beta 1 и TGF-beta 2 семейства TGF-beta, описываются, как имеющие профибротический характер, в то время как TGF-beta 3 имеет более разнообразное действие, которое может усиливать или замедлять прогресс фиброза (30, 31). Последнее предположение поддерживается наблюдением, что экзогенный TGF-beta 3 может блокировать эффект TGF-beta 1 и таким образом предотвращать фиброз в поврежденном легком (32). Исход саркоидоза может быть предопределен генетическими факторами, которые управляют иммунным ответом и последующим восстановленим и ремоделированием поврежденной ткани. Аналогично TGF-beta 1, функциональные полиморфизмы TGF-beta 3 могут находится в сильном сцеплении со связанными с фиброзом SNPs, что может вести к уменьшению экспрессии TGF-beta 3. Следовательно, это может вызывать изменения экспрессии TGF-beta 1 и возможно TGF-beta 2, что может приводить к неблагоприятному исходу саркоидоза. Такие предположения могут быть подтверждены только в функциональных исследованиях.

Результаты нашего исследования указывают, что варианты гена TGF-beta 3 связаны с легочным фиброзом. Доступные данные КТВР подтвердили фиброзный харатер изменений, которые находятся в соответствии с тремя основными паттернами фиброза, описанными Abehsera (20). Хотя связь между различными паттернами КТВР и полиморфизмами TGF-beta 3 не могли быть идентифицированы из-за малого размера исследования, изучение большой группы пациентов с фиброзом, может позволить обнаружить дополнительные связи между полиморфизмами TGF-beta и различными паттернами фиброза.

5 пациентов, которые имели стадию II и 9 пациентов, которые имели стадию III, прогрессировали к стадии IV через 4 года. Недавнее исследование Akira (33) показало, что КТВР не позволяет различать помутнения по типу матового стекла, которые или исчезли или развились в сотовом легком, в среднем через 7.4 года. Связь между вариантами гена TGF-beta 3 и фиброзом не была бы найдена, если бы мы не наблюдали этих пациентах в течение продолжительного периода. Таким образом, продолжительный период наблюдения (несколько лет), является обязательным, чтобы идентифицировать группу пациентов с очевидным легочным фиброзом для генетических исследований.