The Journal of Immunology, 2007, 179: 4255-4262.

Варианты гена TGF-beta1 при хронической бериллиевой болезни и саркоидозе

Alexas C. Jonth, Lori Silveira, Tasha E. Fingerlin, Hiroe Sato, Julie C. Luby, Kenneth I. Welsh, Cecile S. Rose, Lee S. Newman, Roland M. du Bois, Lisa A. Maier, The ACCESS Group, Robert H. Hollis
Laboratory of Environmental and Occupational Health, Division of Environmental and Occupational Health Sciences, Department of Medicine, National Jewish Medical and Research Center; Department of Preventive Medicine and Biometrics, University of Colorado and Health Sciences Center; Division of Pulmonary and Critical Care Sciences, Department of Medicine, University of Colorado, Health Sciences Center, Denver, CO 80262; and Clinical Genomic Group, Royal Brompton Hospital and National Heart and Lung Institute, Imperial College of Science, Technology and Medicine, London, United Kingdom

Реферат

Существуют данные о генетической предрасположенности к хронической бериллиевой болезни и к саркоидозу, которые являются клинически и патологически подобными гранулематозными болезнями легкого. TGF-beta1, цитокин, играющий важную роль в фиброзном ответе, имеет несколько генетических вариантов, которые могут предрасполагать индивидуумов к этим болезням легкого. Мы исследовали, имеют ли некоторые варианты и гаплотипы TGF-beta1 более высокую частоту у пациентов с хронической бериллиевой болезню и саркоидозом по сравнению с контрольной группой и связаны ли они с индикаторами серьезности обеих болезней. Ткани пациентов с саркоидозом, участвующих в исследовании ACCESS, пациентов с хронической бериллиевой болезнью и соответствующих групп контроля, были проанализированы с помощью ПЦР для поиска вариантов TGF-beta1. Никаких существенных различий не было найдено между пациентами и контольной группой по частоте вариантов или гаплотипов TGF-beta1 для обеих болезней. -509C и кодон 10T были сильно связаны с индикаторами серьезности болезни и при хронической бериллиевой болезни и при саркоидозе. Гаплотипы, которые включали и -509C и кодон 10T, также были связаны с более серьезной болезнью, принимая во внимание, что -509T и кодон 10C защищали от серьезной болезни и при саркоидозе и при хронической бериллиевой болезни. Эти результаты говорят, что -509C и кодон 10T, связанные с более низким производством TGF-beta1, являются раличными факторами восприимчивости, связанными с более серьезной гранулематозной болезнью при саркоидозе и при хронической бериллиевой болезни. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы коррелировать белковые уровни TGF-beta1 с известными генотипами TGF-beta1 и оценить, имеются ли общие механизмы действия TGF-beta1 при этих двух гранулематозных болезнях.

Введение

Хроническая бериллиевая болезнь - гранулематозная болезнь легкого, вызванная воздействием бериллия (4), которая характеризуется формированием антиген-специфического, олигоклонального CD4+ T-клеточного иммунного ответа на бериллий (1). Индивидуумы с хронической бериллиевой болезнью имеют гранулематозное воспаление с неказеозными легочными гранулемами и демонстрируют чувствительность к бериллию в тесте пролиферации лимфоцитов с бериллием. Чувствительность к бериллию связана с эпитопами HLA класса II, прежде всего с глютаматом в позиции 69 (Glu69) и в меньшей степени с Glu HLA-DRB1 (2). Генетические факторы, участвующие в серьезности и в восприимчивости к болезни изучены плохо.

Саркоидоз - системная гранулематозная болезнь неизвестной этиологии, которая чаще всего поражает легкие и лимфатические узлы. Как и при хронической бериллиевой болезни, иммунный ответ - T-клеточный, причина или триггер саркоидоза остаются неизвестными (3). Имеются данные, что различные фенотипы болезни генетически детерминированы и связаны со специфическими аллелями MHC (4, 5, 6) и существуют свидетельства олигоклональности T-клеточного ответа (7, 8, 9). Связь с MHC и олигоклональность поддерживают концепцию антиген-специфического ответа, как и при хронической бериллиевой болезни, даже при том, что причинный агент саркоидоза пока не идентифицирован. Как и хроническая бериллиевая болезнь, саркоидоз вероятно является мультигенной болезнью.

TGF-beta1 - многофункциональный цитокин, участвующий в процессах роста и дифференцирования клетотк, фиброзе и иммуномодуляции. Были идентифицированы несколько функциональных полиморфизмов единичного нуклеотида (SNP) гена TGF-beta1, включая C-509T, кодон 10 (T + 29C) и кодон 25 (G + 74C) (10). Аллели C-509T и кодон 10 связаны с более высокими белковыми уровнями TGF-beta1 в сыворотке. Также, кодон 10 связан с увеличенными уровнями мРНК TGF-beta1 (11, 12) в то время как SNP G + 74C ведет к более высоким белковым уровням TGF-beta1 in vitro (13).

Высокое производство TGF-beta1 было связано с несколькими болезнями, включая легочный саркоидоз (14). Многочисленные исследования продемонстрировали, что хроническая бериллиевая болезнь и саркоидоз имеют генетические факторы, ответственные за восприимчивость к болезни (2, 4, 5, 15). Учитывая важную роль, которую TGF-beta1 играет в производстве внеклеточного матрикса и иммуномодуляции а также клиническое, патологическое и иммунологическое подобие между хронической бериллиевой болезнью и саркоидозом, мы выдвинули гипотезу, что одни и те же генетические факторы, связанные с геном TGF-beta1, будут важны в патогенезе из этих двух неинфекционных гранулематозных болезней. Кроме того, мы выдвигаем гипотезу, что полиморфизмы TGF-beta1, связанные с усиленеим иммунного ответа при хронической бериллиевой болезни и саркоидозе, будут связаны с маркерами серьезности болезни.

Материалы и методы

Исследование дизайна случай-контроль проводилось, используя две группы: пациенты с саркоидозом с согласованной группой контроля и пациенты с хронической бериллиевой болезнью с соответствующей группой контроля.

В исследовании использовались данные пациентов с саркоидозом (n = 198) из исследования ACCESS. Пациенты с саркоидозом, сообщившие о возможном воздействии бериллия были исключены из исследования, если они имели положительный тест пролиферации лимфоцитов при воздействии бериллия (BeLPT). Группа пациентов с саркоидозом (198 случаев) была выбрана из большей группы исследования ACCESS таким образом, чтобы она была согласованной по полу, расе и месту проживания с пациентами с хронической бериллиевой болезнью. Соответствующая группа контроля (n = 198) была согласована по возрасту, полу, расе и месту проживания (17).

Пациенты с хронической бериллиевой болезнью (n = 130) и соответствующая группа контроля (n = 135) были привлечены в исследование из числа пациентов, проходивших амбулаторную оценку в Occupational and Environmental Medicine Clinic at National Jewish Medical and Research Center по поводу респираторных симптомов или направленных службами по охране труда, имевших два положительных BeLPT с периферической кровью или один положительный BeLPT с ЖБАЛ, у которых при биопсии были обнаружены неказеозные гранулемы (2). Группа контроля имела документированное воздействие бериллия и по крайней мере один отрицательный тест BeLPT и была согласована по возрасту, полу, расе, месту работы и месту проживания с пациентами.

Результаты

Демографические и клинические особенности пациентов

Контрольная группа хронической бериллиевой болезни была старше, чем пациенты с хронической бериллиевой болезнью и пациенты с саркоидозом с соответсвующей контрольной группой. Большее количество женщин было представлено среди пациентов с саркоидозом и в соответствующей группе контроля, среди пациентов с хронической бериллиевой болезнью и в соответствующей группе контроля с более высоким процентом не белых пациентов, что ожидалось исходя из ранее опубликованных данных относительно демографии болезни. Пациенты с саркоидозом имели умеренные рентгенографические ненормальности, лечение стероидами проводилось у небольшого числа пациентов (22). Значительно больший процент пациентов с хронической бериллиевой болезнью когда-либо получали стероиды или другие иммуносупрессивные средства по сравнению с пациентами с саркоидозом из исследования ACCESS. Частоты генотипа для всех полиморфизмов для контрольных групп соответсвовали закону Харди-Вайнберга. Никаких существенных различий не было найдено для любого из полиморфизмов между группами пациентов и соответствующими контрольными группами.

Анализ гаплотипов

Самая сильная связь была обнаружена между аллелями -509 C и кодоном 10 T (D ' 0.95 CI = 0.91-0.98, r2=0.67). Неравновесность сцепления была найдена между C-509T и G-800A (D ' = 1.0, CI = 0.84-1.0, r2=0.054). В результате, первые три SNP (-800/-509/кодон 10) формировали один блок с неравновесным сцеплением. Более слабая связь наблюдалась между этими полиморфизмами и кодонами 25 и 263 (r2=0.003-0.08). Был выполнен анализ частот для гаплотипов, содержащих 1) все SNP и 2) только три SNP, входящих в один блок с неравновесным сцеплением. Никаких существенных различий между пациентами и контрольной группой для каждой из болезни для любого набора гаплотипов найдено не было.

Серьезность хронической бериллиевой болезни

Была исследована связь степени прогресса хронической бериллиевой болезни с полиморфизмами TGF-beta1, с учетом возраста, пола, расы, статуса курения, параметров функции легкого и промежутка времени от первого воздействия бериллия. Этот анализ был ограничен белыми пациентами, из-за малого числа пациентов другой расы. Пациенты с хронической бериллиевой болезнью гомозиготные по T в кодоне 10, имели в среднем на 0.03 л в год большее уменьшение FVC, чем пациенты без нуклеотида T в кодоне 10 (p < 0.0001). Аналогично, пациенты с хронической бериллиевой болезнью гомозиготные по T в кодоне 10, также имели значительно большее уменьшение в FEV1, TLC и PaO₂ в покое и при максимальной физической нагрузке, чем пациенты, имевшие по крайней мере один нуклеотид C в этом локусе. Пациенты, гомозиготные по C в позиции -509 имели значительно более низкие TLC и PaO₂ в покое и приа максимальной физической нагрузке, чем пациенты по крайней мере с одним нуклеотидом T в позиции -509. Никаких связей не было найдено для других полиморфизмов.

Также была исследована связь степени прогресса хронической бериллиевой болезни с гаплотипами. Пациенты с хронической бериллиевой болезнью, гомозиготные по GCT, имевшие два аллеля, которые, как мы уже раньше показали, связаны с более серьезной болезнью, имели значительно большее уменьшение FEV1, FVC, TLC и PaO₂, в покое и при максимальной физической нагрузке в течение болезни, чем пациенты, которые не несли этот гаплотип. Напротив, пациенты с хронической бериллиевой болезнью, с гаплотипом GTC, имели менее серьезное уменьшение FEV1, FVC, TLC и PaO₂ в состоянии покоя и при максимальной физической нагрузке в течение болезни, чем пациенты, не несущие этот гаплотип. Связи между GTC гаплотипом и рентгенографическими ненормальностями или лечением стероидами обнаружено не было.

Серьезность саркоидоза

Была оценена связь маркеров серьезности болезни, включая спирометрию и рентгенографическую стадию для белых пациентов с саркоидозом с аллелями TGF-beta1 с учетом пола, статуса курения и количества пачек сигарет в год и возраста. Индивидуумы, гомозиготные по CC в позиции -509 более вероятно имели более серьезную болезнь (стадия II, III, IV) чем пациенты с генотипом CT или TT (OR = 2.5, CI (1.3, 4.5)). Аналогично, пациенты гомозиготные по TT в кодоне 10, более вероятно имели более высокую рентгенографическую стадию, чем пациенты с генотипом TC или CC (OR = 2.3, CI (1.1, 4.5). Аналогичная тенденция наблюдалась для генотипа CC в кодоне 263, но эта связь не была статистически значимой.

Индивидуумы с двумя копиями гаплотипа GCT имели тенденцию иметь более серьезную рентгенографическую стадию (OR = 2.2 (0.96-0.4.9, p = 0.06)). Напротив, индивидуумы гомозиготные по -800/-509/кодон 10 GTC, менее вероятно имели стадию II, III или IV (OR = 0.39 (0.20-0.76) p = 0.005).

Небольшая часть пациентов с саркоидозом имела узловатую эритему, которая связана с менее серьезной формой саркоидоза (27). 11 из 12 (91.7 %) этих пациентов, имели по крайней мере один нуклеотид T в позиции -509, в отличие от 53.1 % в группе без узловатой эритемы. Это совместимо с предположенеим, что аллель -509 связан с менее серьезной болезнью. Аналогично, 91.7 % пациентов с узловатой эритемой имели по крайней мере один нуклеотид C в кодоне 10 по сравнению с 67.5 % в группе без узловатой эритемы. Существенных связей между FEV1, FVC или FEV1/FVC и вариантами TGF-beta1 найдено не было.

Обсуждение

Наше исследование впервые идентифицировало связь между прогрессом хронической бериллиевой болезни и вариантами гена TGFbeta-1. Поразительно, что же самый паттерн генотипов и гаплотипов был связан с более серьезной болезнью при другой гранулематозной болезни, саркоидозе, в то время как другие генотипы были связанны с более умеренной формой саркоидоза. О подобном соответствии между различными гранулематозными процессами ранее не сообщалось, и, таким образом, поддерживает нашу гипотезу, что эти гранулематозные болезни имеют общие генетические факторы. Гаплотип восприимчивости к прогрессу обеих болезней включает два локуса (-509 и кодон 10) которые, как известно, являются функциональными и связаны с более высокими уровнями мРНК TGF-beta1 у моноцитов периферической крови или белковыми уровнями TGF-beta1 в сыворотке (11, 12). Кодон 25 также является полиморфным участком, причем аллель дикого типа ведет к более высоким уровням TGF-beta1 (13).

Локус TGF-beta1, в частности, полиморфизмы -509 и кодон 10, были связаны с более серьезной формой различных болезней легкого, включая муковисцидоз (28) и идиопатических легочный фиброз (IPF) (29), но не с восприимчивостью к развитию болезни. Интересно, что оба этих исследования использовали физиологические маркеры серьезности или прогресса болезни, FEV1 в случае муковисцидоза и альвеолярно-артериальный кислородный градиент, в случае IPF. Это поддерживает наши результаты, что ген TGFbeta-1 модифицирует течение болезни легкого, но не связан с восприимчивостью к болезни. Чтобы изучить серьезность хронической бериллиевой болезни, мы оценили изменения параметров функции легкого с учетом других факторов, включая статус курения, возраст, время после первого воздействия бериллия, предполагая, что воздействие может влиять на прогресс и серьезность болезни (30). При саркоидозе, мы использовали рентгенографические стадии как маркер серьезности болезни. Мы не обнаружили связи между саркоидозом и спирометрическими данными во время постановки диагноза. Однако, мы не имели информации о DLco и других переменных позднее в течение болезни, что возможно объясняет отсутствие связи. Интересно, что при муковисцидозе и IPF, маркеры серьезности болезни были связаны с полиморфизмами, ответственными за более высокое производство TGFbeta-1. Однако, другие исследования показали, что те же самые варианты являются защитными для ХОБЛ (31, 32) и связанны с более низким FEV1 при ХОБЛ (32). Это говорит, что одни и те же генетические полиморфизмы могут функционировать по разному, в зависимости от болезни, факторов окружающей среды и возможно от других генетических факторов.

Данные, что аллели -509C и кодон 10T и их гаплотипы связаны с постоянным прогрессирующим ухудшением TLC и параметоров газообмена в покое и при физической нагрузке в случае хронической бериллиевой болезни и с рентгенографической стадией саркоидоза, говорят, что ген TGF-beta1 при этих двух гранулематозных болезнях является функциональным и может иметь подобный механизм действия. TGF-beta1 имеет много различных функций, включая рост и дифференцирование клеток, производство внеклеточного матрикса, фиброз, провоспалительные и противовоспалительные эффекты.

То, что более серьезные формы этих двух болезней связаны с фиброзом, позволяло предположить, что более высокие уровни TGF-beta будут найдены при более серьезных формах болезни с серьезным фиброзом (14). Однако, генотипы, связанные с более серьезной формой хронической бериллиевой болезни и саркоидоза были теми же самыми, как и в предыдущих исследованиях, которые были связаны с более низкими уровнями TGF-beta (11, 33). Это может указывать, что TGF-beta1 не играет важной роли в фиброгенезе, но может участвовать в иммунном регулировании при этих гранулематозных болезнях. Недавние исследования показали, что TGF-beta участвует в отрицательном регулировании и врожденного и приобретенного иммунитета (34, 35, 36). Oida (34) показал, что иммуносупрессивные свойства TGF-beta1 опосредованы CD4+CD25+ регулирующими Т-клетками. Более низкое производство TGF-beta, ожидаемое у носителей -509 CC и кодона 10TT при хронической бериллиевой болезни и саркоидозе, могло вести к ослаблению ингибирования иммунного ответа TGF-beta1 что в результате создает провоспалительную микросреду, способствующую прогрессу болезни. Предварительные данные, полученные нашей группой поддерживают эту гипотезу, поскольку частота экспрессирующих FoxP3 CD4+CD25+ клеток ЖБАЛ при хронической бериллиевой болезни значительно уменьшена, по сравнению с индивидуумами с чувствительностью к бериллию без болезни (A. Fontenot, личная переписка). Хотя число CD4+CD25+ клеток ЖБАЛ при саркоидозе увеличено, их функция нарушена, что возможно отражает дефект иммуносупрессивного действия TGF-beta1 при саркоидозе (37).

Дополнительно поддерживает эту гипотезу наши данные, что присутствие даже одной копии гаплотипа, содержащего -509T и кодон 10C, связано с отсутствием ухудшения FEV1, FVC, TLC и PaO₂ в покое или при максимальной физической нагрузке при хронической бериллиевой болезни и с более низким риском развития стадий II, III и IV при саркоидозе. Примечательно, что эти генотипы были обнаружены у большинства индивидуумов с доброкачественной, спонтанно разрешающейся формой саркоидоза с узловатой эритемой. В этом отношении интересно, что в исследовании уровней TGF-beta1 в супернатанте культуры клеток ЖБАЛ пациентов с саркоидозом (38) показало, что пациенты со спонтанной ремиссией в пределах 6 месяцев, имели значительно более высокие уровни производства TGF-beta, чем пациенты с персистирующей или прогрессирующей болезнью. Эти данные совместимы с нашими результатами, что генотипы, связанные с боее серьезной болезнью, также связаны с более низким производством TGF. Эти данные позволяют сделать два важных предположения: 1) гены, ответственные за болезнь не обязательно связаны с прогрессом или серьезностью болезни, и 2) имеется спектр эффектов, который определяется множеством генов, каждый из которых вносит вариабельный вклад, возможно влияющий друг на друга, определяющий начало, серьезность и исход болезни. Мы могли бы исследовать эту проблему более детально, изучив подгруппу Glu69-позитивных пациентов, чтобы установить наличие связи с серьезностью болезни в этой подгруппе. К сожалению, число этих пациентов в нашем исследовании было слишком мало, но это является важной темой будущих исследований.

Функция TGF-beta при хронической бериллиевой болезни до настоящего времени не изучалась. Однако, полученные нами данные предлагают, что при хронической бериллиевой болезни и при саркоидозе, уменьшенное производство TGF-beta1связано с уменьшением экспансии и ослаблением иммуносупрессивных способностей CD4+CD25 T-клеток, которые присутствуют при хронической бериллиевой болезни (A. Fontenot, личная переписка) и уменьшают воспаление и влияют на функцию Th1 клеток и макрофагов (35, 36). Предыдущие исследования показали, что TGF-beta1 может влиять на пролиферацию, модулировать хемотаксис и регулировать производство Th1 цитокинов, включая TNF и даже влиять на экспрессию MHC класса I и II (13, 39), что может влиять на воспаление при этих двух болезнях. Недавнее исследование Meng с коллегами (40) поддерживает эту концепцию, поскольку они обнаружили более высокую степень пролиферации T-клеток в ответ на аллергены, связанную с полиморфизмом 509CC.

Наше исследование показало, что специфические генотипы и гаплотипы TGF-beta связаны с более серьезным фенотипом легочной болезни и при саркоидозе и при хронической бериллиевой болезни, но не связаны с восприимчивостью к болезни. Прогресс болезни был связан с аллелями, ответственными за более низкое производством TGF. Иммунное регулирование, в котором участвует TGF, является по крайней мере частью механизма, посредством которого болезнь становится прогрессирующей. Будущие исследования необходимы, чтобы оценить функциональные значения этих ассоциаций.