Thorax 2000;55:755-761

Экспрессия тиоредоксина в саркоидных гранулемах: возможная роль в активации Т-лимфоцитов

Toshiya Kouraa, Yasuhiro Gona, Shu Hashimotoa, Arata Azumab, Shoji Kudohb, Yuh Fukudac, Isamu Sugawarad, Junji Yodoie, Takashi Horiea
First Department of Internal Medicine, Nihon University School of Medicine, Tokyo, Japan, Fourth Department of Internal Medicine, Nippon Medical School, Japan, First Department of Pathology, Nippon Medical School, Japan, Molecular Pathology Division, The Research Institute of Tuberculosis, Japan Anti-Tuberculosis Association, Japan, Department of Biological Response, Institute for Virus Research, Kyoto University, Japan

Реферат

Введение: активизированные Т-лимфоциты - одна из характерных особенностей саркоидоза. Механизм активации Т-клеток использует экспрессию различных маркеров активации, включая рецепторы интерлейкина-2 (IL-2R). IL-2R был интенсивно исследован, но точный механизм активации остался неизвестным. Хотя тиоредоксин (TRX) производит множество биологических действий, включая стимулирование активности IL-2R, его роль в индукции экспрессии IL-2R T-клеток при саркоидозе не определена. Мы исследовали экспрессию TRX и IL-2R в саркоидный гранулемах, чтобы разъяснить возможную роль TRX в индукции экспрессии IL-2R. Методы: гранулемы в матералах биопсии ткани легкого и лимфатических узлов 5 пациентов с саркоидозом были окрашены с анти-trx и анти-IL-2Ralpha антителами и были измерены уровни TRX в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) 20 пациентов с легочным саркоидозом. Результаты: гранулемы пациентов с саркоидозом показали сильную реактивность к анти-trx антителам. Положительное окрашивание наблюдалось у макрофагов, эпителиоидных клеток и гигантских клеток Ланханса, но не у лимфоцитов. IL-2R был экспрессирован у лимфоцитов в тех же самых гранулемах. Положительная иммунореактивность не была обнаружена в гистологических препаратах 12 индивидуумов группы контроля. Уровни TRX в БАЛ были выше у пациентов с легочным саркоидозом (122.6 (диапазон 20.9-303.3) ng/ml) чем в группе контроля (32.9 (диапазон 16.8-52.8) ng/ml, p < 0.05). Заключение: TRX сильно экспрессирован и производится в гранулемах у пациентов с саркоидозом. Сосуществование иммунореактивности TRX и IL-2R в тех же самых гранулемах говорит, что TRX может действоватьт как местный фактор стимуляции экспрессии IL-2R на T-клетках.

Введение

Саркоидоз - системный гранулематоз неизвестного происхождения, характеризованный хроническим Тh1 воспалительным процессом, формированием гранулем и нарушением нормальной архитектуры легкого (1, 2). Он характеризуется накоплением активизированных Т-лимфоцитов и макрофагов в вовлеченных органах (1, 2). Активизированные T-клетки имеют CD4+ фенотип и экспрессируют различные маркеры активации на их поверхности, включая IL-2R (1-4). Хотя предлагалось, что активация CD4+ T-клеток - стержневой шаг в событиях, ведущих к формированию гранулем при саркоидозе (1, 2), его этиология и точный механизм активации Т-клеток в местах актвности болезни все еще неизвестны.

Тиоредоксин (TRX) первоначально был идентифицирован в супернатанте HTLV-1 -инфицированной линии клеток как индуктор IL-2R-alpha (5, 6). TRX имеет разнообразную биологическую активность (9), включая синергизм IL-1 и IL-2, индуцирование пролиферации трансформированных вирусом Эпштейна-Барра B-клеток (10), увеличение пролиферативного ответа лимфоцитов на IL-2 (11) и связывание нескольких факторов транскрипции, включая АР-1 и NF-kappaB (12-14). Таким образом, TRX может играть критическую роль в активации лимфоцитов, включая экспрессию IL-2R и пролиферацию. Однако, его роль в индукции экспрессии IL-2R на лимфоцитах у пациентов с саркоидозом не была определена. Поэтому мы окрашивали гранулемы пациентов с саркоидозом с анти-TRX антителами и измерили уровни TRX в БАЛ, чтобы оценить роль TRX при саркоидозе. Одновременно мы окрашивали гранулемы с анти-IL-2R антителами, чтобы определить его IL-2R-стимулирующую активность.

Методы

Пациенты

Группа исследования состояла из 20 некурящих пациентов с легочным саркоидозом (12 мужчин) со средним возрастом 40 лет (диапазон 20-75 лет). Диагноз саркоидоз был установлен в соответствии с клиническими и рентгенографическими результатами и гистологическим подтверждением наличия неказеозных гранулем в материалах биопсии легкого, полученных при трансбронхиальной, торакоскопической или хирургической биопсии. Активность саркоидоза во время проведения биопсии определялась по следующим критериям: (1) увеличение индекса лимфоцитов в БАЛ и увеличенное отношение CD4/CD8 в БАЛ; (2) увеличенные серологические уровни АПФ и (3) положительные результаты сцинтиграфии с галлием-67. На основании этих критериев, все пациенты в этом исследовании имели активную болезнь. Один пациент имел нормальную рентгенограмму (рентгенографическая стадия 0); 8 имели двустороннюю внутригрудную лимфаденопатию (BHL) (стадия I); 9 имели BHL и паренхиматозную болезнь (стадия II); и 2 имели паренхиматозную болезнь без BHL (стадия III). Ни у одного пациента лечение кортикостероидами не проводилось.

Для иммуногистохимического анализа, образцы ткани легкого 8 пациентов (4 мужчины), средний возраст 63 года (диапазон 51-68 лет), у которых была поведена операция по поводу рака легкого (все пациенты имели аденокарциному) и 4 пациентов (2 мужчины) средний возраст 30 лет (диапазон 26-48 лет), у которых была поведена операция по поводу пневмоторакса из-за буллезной болезни, использовались как группа контроля. При определении уровней TRX в БАЛ, 4 пациента с аденокарциномой легкого (2 мужчины), средний возраст 57 лет (диапазон 39-68 лет) и 6ь пациентов с кровохарканьем (2 мужчины), средний возраст 31 год (диапазон 26-58 лет), вошли в группу контроля.

Ни пациенты ни индивидуумы группы контроля никогда не курили. Информированное согласие было получено у всех пациентов, участвующих в исследовании.

Результаты

TRX при саркоидозе

5 образцов ткани легкого и 5 лимфатических узлов пациентов с саркоидозом были окрашены анти-trx антителами. Сильное окрашивание TRX наблюдалось в гранулемах и диффузное окрашивание внутри гранулем гистологических препаратов легкого и лимфатических узлов. Положительное окрашивание наблюдалось у макрофагов, эпителиоидных клеток и гигантских клеток Ланханса, но не у лимфоцитов во всех образцах ткани других пациентов. Иммуноокрашивание не было обнаружено в гранулемах ткани легкого и лимфатических узлов и в гистологических препаратах легкого группы контроля, окрашенных анти-trx антителами.

IL-2R альфа при саркоидозе

5 образцов ткани легкого и 5 лимфатических узлов от пациентов с саркоидозом были окрашены анти-IL-2R-alpha антителами. IL-2R-alpha положительно окрашивался у лимфоцитов во всех гистологических препаратах легкого и лимфатических узлов. Все образцы легкого и лимфатических узлов других пациентов дали подобные результаты. Иммуноокрашивания не было обнаружено в гранулемах ткани легкого и лимфатических узлов и в гистологических препаратах легкого группы контроля, окрашенных анти-IL-2R-alpha антителами.

Уровни TRX в БАЛ

БАЛ пациентов с саркоидозом содержал большее количество TRX (122.6 (диапазон 20.9-303.3) ng/ml) чем в группе контроля (32.9 (диапазон 16.8-52.8) ng/ml; p < 0.05). Подобные результаты были получены, когда БАЛ был проанализирован с коррекцией на уровень альбумина (саркоидоз: 15.3 (диапазон 4.3-38.9) ng / µ альбумин г; группа контроля: 5.2 (диапазон 1.7-9.1) ng / µ альбумин г; p < 0.01). Эти результаты указывают, что TRX фактически поизводится в микросреде гранулемы. Уровни TRX в БАЛ коррелировали с абсолютным числом лимфоцитов (r = 0.68, p < 0.05), процентом лимфоцитов в БАЛ (r = 0.66, p < 0.05) и с отношением CD4/CD8 в БАЛ (r = 0.60, p < 0.05).

Обсуждение

Иммуноокрашивание анти-trx антителами гранулем легкого и лимфатического узла пациентов с саркоидозом, показало сильную реактивность. Положительное окрашивание наблюдалось у макрофагов, эпителиоидных клеток и гигантских клеток Ланханса, но не у лимфоцитов. IL-2R-alpha был экспрессирован на лимфоцитах. Напротив, положительная иммунореактивность не была обраружена в гистологических препаратах легкого группы контроля. Эти результаты показывают, что положительное окрашивание TRX специфичено для гранулем пациентов с саркоидозом и что иммунореактивность TRX и IL-2R сосуществуют в гранулемах этих пациентов. Кроме того, уровни TRX в БАЛ были выше у пациентов с легочным саркоидозом, чем в группе контроля.

Увеличенная экспрессия IL-2R на T-клетках в местах активности болезни хорошо документирована (3, 4); однако, механизм индукции IL-2R на T-клетках не был разъяснен. Рассматривались несколько возможных механизмов. Во-первых, цитокины, включая IL-1, могут участвовать в индукции экспрессии IL-2R на T-клетках, поскольку IL-1 имеет IL-2R-стимулирующую активность (17) и экспрессирован на макрофагах в саркоидных гранулемах (18, 19). Во-вторых, IL-2 может участвовать в индукции экспрессии IL-2R, так как IL-2 per se может стимулировать его рецепторы на T-клетках (20) и увеличивать экспрессию IL-2 на T-клетках в саркоидных гранулемах (21, 22). В-третьих, презентация антигена T-клетками макрофагами может вести к активации Т-клеток, приводящей к индукции IL-2R, так как сообщалось об антигенном триггеринге рецептора Т-клеток (23, 24). В любом случае, производство цитокинов, которые активизируют T-клетки и активация антиген-презентирующих клеток, включая макрофаги, является стержневым этапом в индукции экспрессии IL-2R на T-клетках. Однако, этиология саркоидоза и механизм активации макрофагов все еще неизвестны. В этом исследовании мы показали, что положительное окрашивание TRX на макрофагах и эпителиоидных клетках и положительное окрашивание IL-2R на лимфоцитах было обнаружено в тех же самых гранулемах пациентов с саркоидозом. Кроме того, уровни TRX в БАЛ были выше у пациентов с легочным саркоидозом чем в группе контроля. Так как TRX стимулирует активацию лимфоцитов, включая экспрессию IL-2R (5, 6), эти результаты указывают, что местное производство TRX может участвовать в индукции экспрессии IL-2R.

Сообщалось, что TRX - стресс-индуцированный протеин. Экспрессия TRX может быть индуцирована различными окислительными стрессами, например лечением перекисью водорода, Х-лучами, UV-излучением, вирусной инфекцией и стимуляцией фактора некроза опухоли альфа (8, 9, 25) Кроме того, митогенная стимуляция лимфоцитов и макрофагов и IFN-gamma стимулируют экспрессию TRX на этих клетках (26, 27). Имеется несколько возможных механизмов, посредством которых TRX индуцируется на макрофагах и эпителиоидных клетках. Альвеолярные макрофаги у пациентов с саркоидозом, производят более реактивные соединения кислорода и экспрессировали марганцевую супероксиддисмутазу (28, 29). При этих обстоятельствах, вероятно, что белок типа TRX может быть индуцирован окислительным стрессом, в то время как значение окислительного стресса при саркоидозе не разъяснено. IFN-gamma, который играет важную роль в формировании гранулемы при саркоидозе (19, 30), способен стимулировать TRX (25) и может участвовать в индукции экспрессии TRX на макрофагах и эпителиоидных клетках. Однако, точный механизм этой индукции не известен.

Мы проанализировали связь между уровнями TRX в БАЛ и абсолютным числом и процентом лимфоцитов и отношением CD4/CD8 в БАЛ. Результаты показали что уровни TRX коррелировали с абсолютным числом лимфоцитов, процентом лимфоцитов и отношением CD4/CD8 в БАЛ, указывая на близкую связь между уровнями TRX и активностью болезни. T-клетки экспрессируют IL-2R, который способен к связыванию IL-2 и IL-15 (31). Накопление активизированных T-клеток представляет стержневой шаг в событиях, ведущих к формированию гранулемы. Так как TRX увеличивает пролиферативный ответ лимфоцитов на стимуляцию IL-2 и IL-2R, увеличенные уровни TRX могут вносить вклад в пролиферацию лимфоцитов. Эта гипотеза поддержана корреляцией уровней TRX с абсолютным числом и процентом лимфоцитов в БАЛ. Таким образом, TRX скорее может действовать как предрасполагающий фактор в патогенезе саркоидоза, чем результат болезни. Однако, дальнейшие исследования необходимы, чтобы определить, является ли увеличенный уровень TRX у пациентов с саркоидозом результатом болезни или предрасполагающим фактором к ней.

Мы обнаружили высокую иммунореактивность TRX в гранулемах ткани легкого и лимфатического узла у пациентов с саркоидозом. TRX был обнаружен у макрофагов, эпителиоидных клеток и клеток Ланханса. IL-2R также окрашивался в гранулемах. Кроме того, уровни TRX в БАЛ были увеличены. Эти результаты указывают, что TRX, который имеет IL-2R-стимулирующую активность, может играть важную роль в индукции экспрессии IL-2R на T-клетках в местах активности болезни у пациентов с саркоидозом. Однако, механизм индукции и точная роль TRX при саркоидозе остается неразъясненной.