Chest. 2001;119:753-761

Полиморфизм гена фактора некроза опухоли бета, но не фактора некроза опухоли альфа связан с прогнозом саркоидоза

Etsuro Yamaguchi, MD; Akihide Itoh, MD; Nobuyuki Hizawa, MD and Yoshikazu Kawakami, MD, FCCP
From the First Department of Medicine, School of Medicine, Hokkaido University.

Реферат

Цель: ранее было идентифицировано несколько генетических маркеров прогноза саркоидоза. Фактор некроза опухоли альфа (TNF -alpha) участвует в патогенезе саркоидоза. Было показано, что индуцированные уровни TNF-alpha или TNF-beta связанны с полиморфизмами гена TNF. Мы исследовали роль таких полиморфизмов в развитии и течение саркоидоза. Пациенты: 110 Японских пациентов с саркоидозом и 161 пациент в группе контроля были генотипированы для трех биаллельных полиморфизмов в области промотора гена TNF-alpha прямым секвестрированием продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полиморфизм гена TNF-beta (TNFB*1/TNFB*2) был обнаружен при Nco I анализе полиморфизма длины фрагмента рестрикции продуктов PCR, охватывающих интрон 1 и экзон 2 гена TNF-beta. Результаты: ни один из полиморфизмов не участвовал в восприимчивости к саркоидозу. Однако, наше исследование идентифицировало аллель TNFB*1, как маркер продолжительного клинического курса саркоидоза. Ремиссия была определена как исчезновение всех клинических симптомов и признаков, активных повреждений, патологии рентгенограммы и патологиии результатов легочных и биохимических тестов. Если вероятность ремиссии у пациентов, гомозиготных для TNFB*2 принять за 1.00, вероятность ремиссии у пациентов с TNFB*1 (генотипы TNFB*1/1 и TNFB*1/2) была 0.48 (доверительный интервал 95 %, от 0.26 до 0.88; p < 0.05). Заключение: аллель TNFB*1 - маркер продолжительного клинического курса у пациентов с саркоидозом. Наше исследование впервые связало полиморфизм гена TNF с прогнозом саркоидоза.

Введение

Саркоидоз - системная гранулематозная болезнь, которая воздействует на различные органы и имеет переменный прогноз. Большинство пациентов имеет короткий благоприятный клинический курс. Однако, некоторые пациенты имеют длительный курс и требуют лечения системными кортикостероидами. В исследовании группы Скандинавских пациентов, Berlin с коллегами (1) сообщили, что HLA-DR17 является маркером хорошего прогноза. Недавно мы показали, что аллель гена АПФ связан с длительным клиническим курсом (2). Другие исследования (3, 4, 5), установили корреляцию между персистированием саркоидоза и некоторыми клиническими переменными, включая отсутствие узловатой эритемы, более старшим возрастом в начале болезни, гипоглобулинемией, уменьшением FVC, увеличением пропорции HLA-DR+ T-клеток в БАЛ и увеличением серологического уровня АПФ в течение курса болезни. Большинство этих маркеров отражают активность болезни. Таким образом, были обнаружены только несколько генетических маркеров прогноза для саркоидоза.

Было установлено, что цитокины играют стержневую роль в развитии альвеолита и формировании гранулем при саркоидозе (6, 7, 8, 9, 10) Считается, что среди цитокинов, фактор некроза опухоли альфа (TNF-alpha), играет критическую роль в формировании и поддержанию гранулем (7, 11, 12). Фактически, этот цитокин находился в фокусе лечения (13). Несколько полиморфизмов гена TNF-alpha (TNFA) были идентифицированы (15, 16). Среди них, аллель 2 в позиции нуклеотида 308, был связан с высокими уровнями транскрипции гена TNF-alpha (17, 18).

TNF-beta (лимфотоксин альфа) - цитокин, который организует лимфоидную регенерацию и формирование зародышевого центра (19, 20). В интроне 1 гена TNF-beta (TNFB), имеется полиморфизм Nco I, состоящий из аллеля TNFB*1 и аллеля TNFB*2 (21). TNFB*1 - менее частый аллель у белых пациентов и связан с более высоким производством TNF-alpha и TNF-beta (22, 23).

Чтобы исследовать возможную роль полиморфизма гена в развитии и прогрессе саркоидоза, мы генотипировали 110 пациентов с саркоидозом и 161 пациента в группе контроля для полиморфизмов TNFA и TNFB. Наши результаты показывают, что полиморфизм TNFB Nco I - новый генетический маркер прогноза саркоидоза у Японских пациентов.

Материалы и методы

Пациенты

110 пациентов с саркоидозом (36 мужчин и 74 женщины) были включены в настоящее исследование. Все пациенты были Японцами и жили на острове Хоккайдо. Диагноз саркоидоз был установлен на основании обнаружения в материалах биопсии неказеозных эпителиоидных гранулем и наличия двустороннего увеличения внутригрудных и/или средостенных лимфатических узлов с или без паренхиматозных инфильтратов в легких, повреждений глаз или кожи без признаков микобактериальной, грибковой или паразитарной инфекции. Ни один из пациентов не имел истории воздействия органических или неорганических материалов, котрые могут вызывать болезнь легкого. Средний возраст пациентов при начальном посещении Hokkaido University Hospital был 39.4 лет (доверительный интервал 95 %, диапазон от 36.3 до 42.6 лет). 8 пациентов имели рентгенографическую стадию 0, 62 пациента стадию I, 30 пациентов стадию II и 10 пациентов стадию III. Исследование было выполнено в соответствии Declaration of Helsinki World Medical Association (1989) и было одобрено Комитетом по этике Hokkaido University Hospital. Письменное информированное согласие было получено у каждого пациента.

Здоровые добровольцы

161 здоровый доброволец входил в группу контроля. Все они были были отобраны из пациентов Hokkaido University Hospital, проходивших ежегодную проверку здоровья. Ни один из них не имел истории болезни легкого, любых легочных симптомов или других болезней. Все добровольцы имели нормальные рентгенограммы легких и лабораторные данные, включавшие анализы крови, анализ мочи и анализы ферментов печени и остаточного азота мочевины (BUN).

Оценка клинических данных

Дополнительная оценка активности болезни включала исследование симптомов, таких как лихорадка, одышка, кашель, мокрота, хрипы, сердцебиения, нарушения зрения, артралгии, зуд и любые другие симптомы, связанных с саркоидозом. Физикальная экспертиза оценивала высыпания на коже, опухание суставов, увеличение поверхностных лимфатических узлов, гепатоспленомегалию, увеличение околоушной железы и любые другие проявления, связанные с саркоидозом. Также проводилась офтальмологическая экспертиза с помощью щелевой лампы и фундоскопия; рентгенограмма; исследования функции легких, включая FEV1/FVC и DLco; ЭКГ; измерение ферментов печени, включая аланиновую аминотрансферазу, аспартат-аминотрансферазу и лактатдегидрогеназу, серологический уровень кальция и АПФ. Все эти оценки повторялась через 3 месяца. Когда все симптомы и физикальные и рентгенографические проявления исчезали, результаты легочной функции, ЭКГ и биохимические тесты были в пределах нормы, случай рассматривался как ремиссия и регистрировался интервал времени от начала болезни до ремиссии. У некоторых пациентов ремиссия в течение исследования не наблюдалась. Отрезок времени от начала болезни до последнего месяца наблюдения у таких пациентах был зарегистрирован и использовался для дальнейшего анализа.

Наши критерии для ремиссии могут покаться поверхностными, так как они не включают БАЛ, сцинтиграфию с галлием-67 или КТ. Однако, полностью оценить клиническую активность саркоидоза весьма трудно. Поскольку саркоидоз - системная болезнь, полная оценка присутствия или отсутствия активных повреждений могла бы потребовать биопсии всех наиболее часто вовлекаемых органов (печени, легкого и лимфатических узлов). Такая исчерпывающая оценка не показана для бессимптомных пациентов. Мы поэтому выполнили основные исследования, которые были прагматичны и рентабельны.

Результаты

Три генотипа TNFB интрон 1 полиморфизма (TNFB*1/1, гомозиготный для TNFB*1; TNFB*1/2, гетерозиготный для TNFB*1 и TNFB*2; TNFB *2/2, гомозиготный для TNFB*2) были однозначно идентифицированы после увеличения 289-bp фрагмента, охватывающего интрон 1 и экзон 2. Генотип и частоты аллелей для 161 Японских пациентов были сопоставимы с наблюдаемыми у белых пациентов и Японских индивидуумов группы контроля (25, 26, 27). Не имелось никаких значительных различий в частоте аллелей или распределении генотипов между пациентами и группой контроля, различия OR в зависимости от возраста и пола не были статистически значимыми. Таким образом, наше исследование не получило доказательств, что любой из полиморфизмов гена TNF участвует в восприимчивости к саркоидозу у Японских пациентов. Мы не обнаружили никакой значительной связи между полиморфизмом TNFB и любой из клинических особенностей болезни. Ни один из полиморфизмов TNFA и TNFB в группе контроля не показал значительных отклонений от ожидаемого согласно закону Харди-Вайнберга.

Затем мы исследовали связь между генотипами и клиническим курсом саркоидоза. Разрешение саркоидоза было определено как момент времени, когда все клинические проявления, включая симптомы, повреждения кожи и офтальмологические ненормальности исчезли и когда рентгенограмма легких, исследования функции легких и биохимические тесты были нормальны. Хотя полиморфизм TNFA не был связан с клиническим курсом саркоидоза, частично из-за очень низкой частоты аллеля, полиморфизм TNFB значительно влиял на вероятность ремиссии. Пациенты с аллелем TNFB*1 (генотип TNFB*1/1 или TNFB*1/2) имели более длительный клинический курс, чем пациенты с генотипом TNFB*2/2, с вероятностью ремиссии 0.48 (95 % CI, от 0.26 до 0.88; p < 0.05). Таким образом, возможность ремиссии у пациентов с аллелем TNFB*1 была приблизительно вдвое меньше, чем у пациентов с генотипом TNFB*2/2.

Использование системных кортикостероидов может быть сильно запутывающим (confound) фактором для клинического курса саркоидоза. В нашем исследованиии имелись только 4 пациента, получавших системные кортикостероиды. Это было связано с тем, что немногие пациенты имели серьезные симптомы или ухудшение функции легкого даже в случаях с длительным курсом болезни, что, частично, подтверждает данные, что кортикостероиды могут быть вредны для этой группы пациентов (28). Когда анализ был ограничен подгруппой пациентов, не получавших кортикостероиды, различия в вероятности ремиссии у этих трех генотипов стали более очевидными. Пациенты с аллелем TNFB*1/1 или TNFB*1/2 имели значительно более длительный клинический курс по сравнению с пациентами с TNFB*2/2 аллелем. Вероятность ремиссии у пациентов с TNFB*1/1 или TNFB*1/2, относительно пациентов с TNFB*2/2, была 0.33 (95 % CI, от 0.11 до 0.97; p < 0.05) и 0.46 (95 % CI, от 0.23 до 0.91; p < 0.05), соответственно.

Клинический курс был проверен в течение > 24 месяца у 77 пациентов и > 60 месяцев у 40 пациентов. Для этих групп, аллель TNFB*1 был хорошим прогностическим фактором. Вероятность ремиссии у пациентов с TNFB*1 аллелем (TNFB*1/1 или TNFB*1/2) которые наблюдались > 24 месяцев или > 60 месяцев, по сравнению с TNFB*2/2 пациентами, была 0.48 (95 % CI, от 0.26 до 0.89; p < 0.05) и 0.53 (95 % CI, от 0.28 до 0.98; p < 0.05), соответственно.

Таким образом, полиморфизм гена TNF-beta является генетическим эпитопом для ''короткого'' или ''промежуточного'' клинического курса у пациентов с саркоидозом.

Обсуждение

Настоящий отчет впервые продемонстрировал, что аллельный полиморфизм TNFB может являться генетическим фактором прогноза у пациентов с саркоидозом. Мы обнаружили, что Японские пациенты с аллелем TNFB*1 имели продолжительный клинический курс. Исследуемая группа состояла преимущественно из пациентов, не требовавших кортикостероидной терапии. Такие пациенты, очевидно, представляют подгруппу пациентов, имеющих проявления болезни от минимальных до умеренных. Поэтому, наши результаты не могут быть применимы к другим этническим группам, которые обычно имеют иное соотношение пациентов, для которых показана системная кортикостероидная терапия. Однако, наши результаты проясняют естественный курс саркоидоза, не требующий терапевтического вмешательства. Действительно, когда анализ был ограничен только пациентами, не получавшими стероидную терапию, результаты были более специфическими. Пациенты с генотипом TNFB*1/1 и с TNFB*1/2, имели значительно продолжительный клинический курс по сравнению пациентами с генотипом TNFB*2/2.

Некоторые данные говорят, что TNF-beta может быть вовлечен в патогенез саркоидоза. Было показано, что TNF-beta играет критическую роль в развитии лимфоидных органов мышей (19). TNF-beta-дефицитные мыши имеют недостаточное развитие брыжеечных и периферических лимфатических узлов и Пейеровых бляшек. Трансгенные TNF-beta мыши имеют значительные локальные клеточные инфильтраты (20). Их лимфатические узлы характеризуются наличием специализированной сосудистой системы, которая экспрессируют молекулы адгезии, такие как внутриклеточная молекула адгезии-1, сосудистая молекула адгезии -1, слизистая молекула адгезии -1. Увеличение лимфатических узлов и накопление лимфоцитов - критерии патологии саркоидоза. Кроме того, молекулы адгезии были обнаружены в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом (29, 30). Из-за этих особенностей, общих для TNF-beta трансгенных мышей и саркоидоза, кажется приемлемым предположение, что дисрегуляция экспрессии TNF-beta может быть фактором, ведущим к развитию и/или прогрессу саркоидоза. Действительно, было показано, что TNFB*1 связан с более высоким производством TNF-beta в периферической крови мононуклеарными клетками, чем TNFB*2 (22). Кроме того, TNFB*1 связан с заменой аминокислоты в позиции 26 TNF-beta (22). Эта замена может приводить к изменению биологической активности TNF-beta. Однако, мы считаем, что прямое доказательство роли TNF-beta в формировании гранулемы и в поддержании воспаления, требует дальнейших исследований.

TNFB*1 также связан с более высоким производством TNF-alpha линиями нестимулированных лимфобластоидных (lymphoblastoid) клеток (23). TNF-alpha - главный медиатор различных воспалительных ответов (31) и было показано, чтобы он определенно вовлечен в механизм формирования гранулемы in vitro (12). Мы ранее продемонстрировали увеличенное производство TNF-alpha альвеолярными макрофагами, полученными из БАЛ пациентов с саркоидозом (7). Как было показано, саркоидные гранулемы показывают увеличенную экспрессию мРНК TNF-alpha (8). Таким образом, связь между полиморфизмом TNFB, производством TNF и критической ролью TNF в формировании гранулемы, поддерживают идею, что полиморфизм гена TNF влияет на процесс ремиссии болезни саркоидоза посредством изменения экспрессии TNF-alpha и/или TNF-beta. Имеется некоторое противоречие относительно связи между полиморфизмом TNFB и экспрессией TNF (32, 33). Однако, наши наблюдения указывают, что полиморфизм TNFB - новый генетический маркер прогноза саркоидоза у Японских пациентов.

Ни один из аллельных полиморфизмов TNFA не был связан с развитием саркоидоза. Наше исследование не идентифицировало TNFB*1 как фактор риска саркоидоза. Это совместимо с результатами, сообщенными Seitzer с коллегами (26). Напротив, Ishihara с коллегами (27) сообщил о значительной ассоциации между TNFB*1 и развитием саркоидоза у Японских пациентов и приписал эту связь неравновесному сцеплению HLA-DR5, HLA-DR6 и HLA-DR8. Очевидное несоответствие между этими результатами может быть объяснено фактом, что наши пациенты имели слабую связь с HLA-DR (неопубликованное наблюдение; март 1998). Это различие, возможно, также наблюдалось из-за стратификиции группы, так как в исследовании Ishihara (27), большинство пациентов было взято из офтальмологических клиник.

Предыдущие исследования генетики саркоидоза (1, 2, 27, 34, 35, 36, 37) продемонстрировали, что генетические факторы участвуют в определении как восприимчивости, так и фенотипа болезни. Сообщалось, что частота саркоидоза была связана с HLA-A1, HLA-B8, HLA-DR3 и HLA-DR17 у белых пациентов (1, 34) и с HLA-DR3, HLA-DR5, HLA-DR6 и HLA-DR8 у Японских пациентов (27). Частота делеции (D) аллеля гена АПФ выше у Японских пациентов женского пола и у чернокожих пациентов, чем в группе контроля (35, 36). По факторам, объясняющим гетерогенность фенотипов, значительные связи были установлены у белых пациентов - между ранним началом болезни и HLA-B13 и HLA-B35, между рентгенографической стадией I и HLA-A1, HLA-B8, HLA-B27 и HLA-DR3 (34). О более высокой частоте TNFA2 в позиции 308, была сообщено для Японских пациентов с кардиосаркоидозом. HLA-DR17 более часто присутствует у пациентов с острым началом болезни (1). HLA-DR17 также связан с нехронической формой болезни, принимая во внимание, что делеция аллеля гена АПФ связана с длительным клиническим курсом (2). Таким образом, различные генетические компоненты по разному воздействуют на восприимчивость и фенотипическую гетерогенность саркоидоза, в зависимости от подгруппы пациентов. Наши результаты - пример генетических факторов, которые объясняют гетерогенность прогноза саркоидоза.

Гены TNF-alpha и TNF-beta находятся в пределах 7 КБ региона главного комплекса тканевой совместимости класса III на хромосоме 6p.21.3 (38). Ввиду физической близости локуса TNF к генам класса II, можно заключить, что связь, обнаруженная в настоящем исследовании, происходит из-за неравновесного сцепления. Фактически, связь TNFB*1 с HLA-A1, HLA-B8 и HLA-DR3 гаплотипом была обнаружена у белых пациентов (40 41). О значительной связи между HLA-DR17 и хорошим прогнозом было сообщено для Скандинавских пациентов с саркоидозом (1). Однако, так как DR17 вообще отсутствовал у Японских пациентов группы контроля и пациентов с саркоидозом (27, 42) его значение невозможно проанализировать. Кроме HLA, несколько других генов, уместных для иммунных реакций - белки-транспортеры и белок температурного шока (70), также расположены около гена TNF на той же самой хромосоме. Дальнейшие исследования будут необходимы, чтобы объяснить, какой из этих генов связан с прогнозом саркоидоза.

Мы обнаружили, что TNFB*1 связан с длительным клиническим курсом саркоидоза у Японских пациентов. Наше исследование предполагает, что специфические генотипы пациентов предрасполагают к худшему клиническому результату, возможно, создавая провоспалительный фенотип.