Am. J. Respir. Crit. Care Med., Volume 165, Number 8, April 2002, 1119-1124

Увеличенная частота редкого -857T аллеля гена фактора некроза опухоли у Британских и Голландских пациентов с саркоидозом

Jan C. Grutters, Hiroe Sato, Panagiotis Pantelidis, Anna L. Lagan, Deirdre S. McGrath, Jan-Willem J. Lammers, Jules M. M. van den Bosch, Athol U. Wells, Roland M. du Bois, and Kenneth I. Welsh
Heart Lung Center Utrecht, Department of Pulmonology, Sint Antonius Hospital, Nieuwegein, the Netherlands; Clinical Genomics Group, Department of Occupational and Environmental Medicine, Imperial College of Science, Technology, and Medicine, National Heart and Lung Institute, London, United Kingdom; and Heart Lung Center Utrecht, Department of Pulmonology, University Medical Center, Utrecht, the Netherlands

Реферат

Различия в экспрессии фактора некроза опухоли альфа (TNF-alpha) у различных индивидуумов предполагают существование функционально различных TNF аллелей, которые могли бы играть определенную роль при саркоидозе. Мы исследовали 5 функциональных биаллельных полиморфизмов промотора гена TNF в позициях -1,031 (T/C), -863 (C/A), -857 (C/T), -307 (G/A) и -237 (G/A) в двух клинически различных группах белых пациентов, (Британских - UK и Голландских - NL) с саркоидозом, и в группах контроля. Полиморфизмы были определены с использованием SSP-PCR. Было исследовано 772 индивидуума (96 пациентов UK, 354 индивидуума в UK группе контроля, 100 NL пациентов, 222 индивидуума NL группе контроля). Существенное увеличение частоты редкой TNF аллели -857T было обнаружено в обоих популяциях пациентов с саркоидозом. 25.5 % пациентов с саркоидозом имели TNF -857T аллель против 14.1 % в группе контроля (p = 0.003, PC = 0.02). В группе пациентов с саркоидозом, частота этого полиморфизма была 13.5 % против 7.3 % в группе контроля (p = 0.0003, PC = 0.002). Анализ показал существенное увеличение редкой TNF -307A (TNF-2) аллели у пациентов с синдромом Лёфгрена (p = 0.006, PC = 0.03). Наши результаты не обязательно подразумевают, что эти два полиморфизма имеют различные функции; возможно, что один из них или оба находятся в неравновесном сцеплении с причинным участком.

Введение

Саркоидоз - сложная болезнь, которая возможно определяется генетической восприимчивостью индивидуума и действием неизвестного антигенного стимула из окружающей среды (1-3). Главная патологическая особенность этой болезни - хроническое воспаление, приводящее к формированию гранулем. При саркоидозе могут быть вовлечены разичные органы, но легкие и лимфатические узлы вовлекаются наиболее часто. Воспалительный ответ при саркоидозе характеризован увеличенным производством нескольких провоспалительных цитокины, включая фактор некроза опухоли альфа (TNF-alpha) и интерлейкин -1 (4). Обычно, производство цитокинов регулируется посредством действия противорегулирующих цитокинов, производства растворимых рецепторов цитокинов и производства антагонистов рецепторов цитокинов. Это указывает на возможный вклад генетических полиморфизмов в межиндивидуальные различия в регулирующих механизмах производства цитокинов. Поэтому, различные генотипы возможно могут вносить вклад в предрасположенность к саркоидозу, усилиление формирования гранулем или модулировать серьезность болезни.

Считается, что TNF-alpha является основным цитокином в патогенезе саркоидоза, из-за его важной роли в формировании гранулемы (5-7). Увеличенное производство TNF-alpha было обнаружено на участках активности болезни (8-10). Имеются свидетельства, что полиморфизмы в регионе промотора гена TNF-alpha влияют на производство TNF-alpha (11-13). Поэтому, ген TNF - важный ген-кандидат при поиске генетической предрасположенности к саркоидозу.

Wilson с коллегами первыми описали полиморфизм гена TNF (нуклеотид G в позиции -307, первоначально ошибочно идентифицированный как -308) в регионе промотора человеческого гена TNF (14, 15). Было обнаружено существенное влияние этого полиморфизма на транскрипцию TNF-alpha. Более редкий аллель -307A (также называемый TNF-2), был связан с более высокими уровнями транскрипции гена (16, 17). Связь между этим полиморфизмом и восприимчивостью к аутоиммуннным болезням изучалась, но очевидного влияния на восприимчивость к болезням продемонстрировано не было (13). Однако, многочисленные сообщения указывали на связь между -307 генотипом и серьезностью инфекционных болезней (13). Известно что некоторые инфекции, характеризованные присутствием внутриклеточных возбудителей (лепра, лейшмания и хламидия), находятся под влиянием этого полиморфизма (18-20).

При саркоидозе, более высокая частота -307A аллеля была найдена у пациентов с синдромом Лёфгрена, но увеличенная частота не была обнаружена при сравнении группы пациентов с саркоидозом с группой контроля (21, 22). Связь -307A аллеля и синдрома Лёфгрена была недавно подтверждена Labunski с коллегами, которые сообщили об связи между этим аллелем и узловатой эритемой при саркоидозе, клинической особенностью синдрома Лёфгрена (23).

Один самых раннних обнаруженных полиморфизмов в регионе промотора гена TNF - замена нуклеотида C на T в позиции -857 (14). В этом случае транскрипционная активность была более высокой (24). Другой полиморфизм промотора TNF в позиции -863, влияет на связывание гомодимера NF-kappaB p50-p50. Этот гомодимер действует как репрессор транскрипции после сцепления с доменом промотора TNF. Однако, сцепление гомодимера NF-kappaB p50-p50 с доменом ингибируется A-вариантом полиморфизма промотора TNF. В результате недостаточного регулирования экспрессии TNF, наблюдается увеличенное производство TNF-alpha (11).

Мы исследовали функциональные полиморфизмы промотора TNF в позициях -307, -857 и -863, в двух клинически четких группах пациентов с саркоидозом из различных стран, чтобы определить связь между этими полиморфизмами и саркоидозом. Для картирования региона промотора TNF, в исследование были включены два других ранее описанных полиморфизма промотора TNF, один в позиции -1,031 и другой в позиции -237 (13, 25).

Методы

Британские пациенты и Британская группа контроля

Были исследованы 96 Британских белых пациентов с саркоидозом. У всех пациентов диагноз саркоидоз был установлен, когда клинико-рентгенографические данные были поддержаны гистологическим свидетельством наличия неказеозных эпителиоидноклеточных гранулем. Письменное согласие было получено у всех пациентов и комитет по этике Royal Brompton Hospital, London, UK, дал разрешение на проведение исследования. Эта больница - третичный центр, принимающий пациентов главным образом с юго-востока UK. В группу контроля было включено 354 белых индивидуумов, главным образом с юго-востока UK.

Голландские пациенты и Голландская группа контроля

100 Голландских белых пациентов с саркоидозом были включены в исследование. У 95 пациентов диагноз саркоидоз был установлен, когда клинические результаты были поддержаны гистологическим свидетельством наличия неказеозных эпителиоидноклеточных гранулем и после исключения других известных причин гранулематоза. У 5 пациентов диагноз был установлен без биопсии, поскольку эти пациенты имели классический синдромом Лёфгрена, лихорадку, узловатую эритему, артралгию и двустороннюю внутригрудную лимфаденопатию (26). Письменное согласие было получено у всех пациентов и комитет по этике Sint Antonius Больницу, Nieuwegein (Utrecht) дал разрешение на проведение исследования. В группу контроля было включено 222 белых донора крови, главным образом из региона Utrecht.

Результаты

И у Британских и у Голландских пациентов мы наблюдали увеличенную частоту TNF -857T аллеля.

Британские пациенты

Мы наблюдали существенное увеличение частоты редкого TNF -857T аллеля у Британских пациентов с саркоидозом по сравнению с Британской группой контроля (chi² 7.39 с 1 df, p = 0.007 [PC = 0.04]). Существенное различие было также найдено по частоте генотипа и фенотипа этого полиморфизма (от chi² до 10.41 с 2 df, p = 0.006 [PC = 0.03] и от chi² до 4.73 с 1 df, p = 0.03 [PC = 0.15], соответственно). В Британской группе пациентов с саркоидозом, 26.0 % индивидуумов несли TNF -857T аллель, по сравнению с 14.1 % в группе контроля. Другие исследованные полиморфизмы промотора TNF , -1,031, -863, -307 и -237, не показали никаких различий в генотипе, фенотипе и частоте аллеля между Британскими пациентами и группой контроля.

Голландские пациенты

Подобно результатам в Британской группе, у Голландских пациентов с саркоидозом была обнаружена более высокая частота редкого TNF -857T аллеля по сравнению с группой контроля (chi² 4.83 с 1 df, p = 0.03 [PC = 0.15]). Как в Британской группе, наблюдалась та же самая тенденция по частоте генотипа и фенотипа этого полиморфизма. В Голландской группе пациентов с саркоидозом 25.0 % индивидуумов несли TNF -857T аллель, по сравнению с 14.0 % в группе контроля (chi² 3.46 с 1 df, p = 0.06). Другие исследованные полиморфизмы промотора TNF , -1,031, -863, -307 и -237, не показали никаких различий в генотипе, фенотипе и частоте аллели между Голландскими пациентами и группой контроля.

Полиморфизм промотора гена TNF и синдром Лёфгрена

11 Голландских и 4 Британских пациента с саркоидозом имели классический синдром Лёфгрена. Мы оценили, имелись ли различия в частоте аллелей изучаемых полиморфизмов промотора между пациентами с синдромом Лёфгрена (n = 15) и другими пациентами с саркоидозом (n = 181). Мы обнаружили увеличенную частоту -307A аллеля у пациентов с синдромом Лёфгрена по сравнению с пациентами без синдрома Лёфгрена (chi² 7.46 с 1 df, p = 0.006 [PC = 0.03]). Интересно, что частота аллеля TNF -857T имела тенденцию быть более низкой у пациентов с синдромом Лёфгрена по сравнению с пациентами без синдрома Лёфгрена (6.7 %, против 14.1 %); однако, это различие не было статистически значимым. Частоты других исследованных полиморфизмов промотора не отличались пациентами с синдромом Лёфгрена по сравнению с пациентами без синдрома Лёфгрена.

Обсуждение

Мы исследовали связь между пятью функциональными полиморфизмами промотора гена TNF и саркоидозом в двух клинически четких группах пациентов из Британии и Нидерландов. Мы обнаружили существенное увеличение частоты аллеля -857T у пациентов с саркоидозом по сравнению с этнически и географически соответствующей группой контроля. Далее, при построении гаплотипов промотора TNF, только один гаплотип, включая T в позиции -857, показал ясную ассоциацию с саркоидозом. Факт, что этот результат был обнаружен в двух различных популяциях, позволяет предположить новый маркер восприимчивости к саркоидозу и даже причинную связь между геном TNF и этой болезнью.

Возможно, TNF -857T аллель является маркером известной связи с HLA при саркоидозе. Однако, вследствии неравновесного сцепления, трудно выделить первичного гена-кандидата. Кроме того, пока еще не было опубликовано данных о неравновесности сцепления для гаплотипов, несущих TNF -857T. Однако, исходя из наших результатов, мы смогли выделить гаплотипы TNF, которые включали позиции -307 и -237, для которых были опубликованы данные по HLA класса I и HLA класса II. Мы можем заключить, что HLA-DR11 и 14, связанные с саркоидозом в некоторых популяциях, вероятно находятся в неравновесном сцеплении с аллелем TNF -857T, но мы не можем определить, какой из них является доминирующим. Исследование этого вопроса требует типирования намного большей группы Европейских пациентов с саркоидозом и/или межрасового картирования.

Поскольку ген TNF - уместный ген-кандидат для саркоидоза, можно предположить роль TNF -857 (C/T) полиморфизма в патогенезе саркоидоза. Полиморфизм промотора гена TNF представляют большой интерес с иммуногенетической точки зрения, поскольку имеются свидетельства, что он может объяснить межиндивидуальные различия производства TNF-alpha при иммунном ответе (11-13). Эти различия являются трудноуловимыми в физиологических состояниях, но под влиянием патогенных стимулов могли бы вносить вклад в воспалительные болезни. Один из наиболее хорошо исследованных полиморфизмов промотора TNF - замена нуклеотида C на А в позиции -863 (11). Udalova с коллегами продемонстрировали влияние этой замены на связывающие свойства различных форм комплекса NF-kappaB (11). Было показано, что гомодимерная форма p50-p50 этого комплекса имеет значительно меньшую аффинность к участку сцепления ДНК -863A. Так как гомодимер p50-p50 действует как транскрипционный репрессор при связывании с регулирующим участком региона промотора гена TNF, ослабление сцепления, возможно, приводит к неадекватному регулированию экспрессии гена TNF и увеличению производства TNF-alpha (11). Возможно, замена нуклеотида C на T в позиции -857 может иметь подобные последствия относительно аффинности других регулирующих ядерных факторов транскрипции.

Другой интересный результат нашего исследования - существенное различие частоты полиморфизма промотора гена TNF в позиции -307 (замена G на А) в подгруппе пациентов с саркоидозом с классическим синдромом Лёфгрена. Наше исследование показало существенное увеличение более редкого аллеля -307A у пациентов с этим синдромом по сравнению с другой группой пациентов (22). Однако, увеличение частоты этого аллеля не было найдено в полной группе пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля. Это говорит о том, что этот полиморфизм может играть роль только в этой специфической подгруппе пациентов с саркоидозом. Кроме того, мы обнаружили более низкую частоту более редкого аллеля -857T у пациентов с синдромом Лёфгрена по сравнению с пациентами без синдрома Лёфгрена, хотя различие не было статистически значимым. Вычисления показали, что для проверки этой гипотезы необходимо исследовать 43 пациента с синдромом Лёфгрена (80 % статистическая мощность, 95 % CI). Мы выдвигаем гипотезу, что в различных подгруппах пациентов с саркоидозом различные полиморфизмы промотора гена TNF могут действовать как гены восприимчивости или как маркеры сцепления для других генов, которые влияют на восприимчивость.

Наблюдаемая связь между синдромом Лёфгрена и полиморфизмом TNF -307 (G/A) также могут быть вызваны неравновесностью сцепления. Саркоидоз, как известно, связан с присутствием HLA-DRB1*0301 аллеля (DR17) у белых пациентов (31). Как было описано ранее, DR3 аллели (включая DR17) находятся в неравновесном с TNF -307A (TNF-2) аллелем (32). Неравновесность сцепления между HLA-DRB1 и TNF, делают определение относительной роли каждого гена в иммуногенетике саркоидоза чрезвычайно трудной. Типирование HLA с более высоким разрешением в комбинации с тонким картированием гена TNF необходимы, чтобы решить эти проблемы и объяснить генетические основы синдрома Лёфгрена у пациентов с саркоидозом.

Настоящее исследование также продемонстрировало важность совместного изучения различных популяций. Факт, что та же самая связь между специфическими полиморфизмами промотора гена TNF и саркоидозом была обнаружена в двух группах пациентов из различных популяций, добавляет вес этим результатам. Поскольку саркоидоз - болезнь с переменной распространенностью и серьезностью в различных расах и этнических группах, сравнение генетических результатов может быть очень трудным. Это явление было обнаружено в исследованиях MHC. Из-за увеличения интереса к генетическим основам сложных болезней, таких как саркоидоз и расширения возможностей для картирования гена-кандидата, эти проблемы также вероятно возникнут при исследовании других генов. Изучение различных этнических групп одновременно могло бы дать мощный инструмент для преодоления некоторых из этих трудностей.

Это первое исследование нескольких полиморфизмов промотора гена TNF при саркоидозе в двух различных популяциях. И у Британских и у Голландских пациентов с саркоидозом мы продемонстрировали существенное увеличение частоты редкого TNF -857T аллеля по сравнению с группами контроля. Кроме того, существенное увеличение частоты редкого TNF -307A аллеля наблюдалось в подгруппе пациентов с саркоидозом с синдромом Лёфгрена. TNF -857 (C/T) полиморфизм возможно является новым маркером восприимчивости к саркоидозу или даже возможным причинным геном. Необходимы дальнейшие исследования функциональных возможностей этого полиморфизма и типирование HLA в комбинации с тонким картированием гена TNF с более высоким разрешением, чтобы разъяснить возможную роль гена TNF в иммуногенетике саркоидоза.