Eur Respir J 2002; 20:1179-1184

Анализ отдельных клеток: новый подход к исследованию синтеза и секреции фактора некроза опухоли при саркоидозе

P. Pantelidis, D.S. McGrath, A.M. Southcott and R.M. du Bois
Interstitial Lung Disease Unit, Dept of Occupational and Environmental Medicine, Royal Brompton Hospital and National Heart and Lung Institute, London, UK

Реферат

Несмотря на противоречивые данные, считается, что фактор некроза опухоли альфа (TNF-alpha), является ключевым цитокином в патогенезе саркоидоза. Хотя в значительной степени TNF-alpha является продуктом активированных мононуклеарных фагоцитов, неясно, является ли производство TNF-alpha на участках болезни особенностью всех мононуклеарных фагоцитов, которые там накапливаются или TNF-alpha секретируется какой-либо субпопуляцией этих клеток. Цель этого исследования состояла в том, чтобы определить, источник увеличенного производства TNF-alpha. Технология reverse haemolytic plaque assay (RHPA) позволяет провести измерение производства цитокинов на уровне одной клетки. Большее число альвеолярных макрофагов производили TNF-alpha, по сравнению с аутогенными моноцитами при саркоидозе, но не в группе контроля. На основании размера клеток, было подтверждено, что TNF-alpha производится большим количеством зрелых макрофагов и что секреция TNF-alpha моноцитами и макрофагами была гетерогенной: не все моноциты и макрофаги секретируют TNF-alpha. Никаких различий в средних уровнях секреции TNF-alpha моноцитами периферической крови или альвеолярными макрофагами не наблюдались. Это исследование продемонстрировало, что субпопуляция мононуклеарных фагоцитов, зрелые макрофаги, является ответственным за секрецию фактора некроза опухоли, и это может иметь значение для лечения саркоидоза в будущем.

Введение

Саркоидоз - гранулематозная болезнь неизвестной этиологии, характеризованная присутствием эпителиоидноклеточных гранулем на участках болезни. Патологически, в ранней стадии болезни, наблюдается приток мононуклеарных клеток, сопровождаемых лимфоцитами. Эти воспалительные клетки затем пространственно организуются в классические гранулемы (1-5).

Фактор некроза опухоли альфа - ключевой цитокин при различных хронических воспалительных болезнях, включая фиброзирующий альвеолит и гранулематозные болезни (6-8). Множество предыдущих публикаций демонстрировали увеличение производства TNF-alpha в разнообразных контекстах (9-16). Секреция TNF в значительной степени была связана с активностью болезни. Однако, возможно, что при стабильной болезни также может наблюдаться низкоуровневая секреция TNF, что объясняет обострения болезни, которые часто наблюдаются.

Вероятно, раннее производство TNF-alpha мононуклеарными фагоцитами является основным фактором инициирования болезни. Однако, не ясно, является ли производство TNF-alpha на участках болезни особенностью всех мононуклеарных клеток, или какой-либо субпопуляцией этих клеток.

Ранее мы продемонстрировали, что может быть измерено производство цитокинов единственной клеткой (16). Технология RHPA имеет преимущество по сравнению с обычным исследованием культуры, поскольку может быть измерено производство цитокинов отдельной клеткой и можно исследовать корреляцию производства цитокинов с типом клеток.

В этом исследовании мы преследовали две цели: 1) подтвердить увеличение производства TNF-alpha и установить, секретируют ли при саркоидозе TNF-alpha все мононуклеарных фагоциты или секреция является гетерогенной; и 2) оценить, имеется ли низкоуровневая непрерывная секреция TNF при хронической болезни, которая может предрасполагать к рецидиву болезни.

Материалы и методы

Пациенты

Группа исследования включала 10 пациентов с саркоидозом (5 пациентов со стадией I, 3 пациента со стадией II и 2 пациента со стадией III) и 10 здоровых индивидуумов. 2 пациента принимали преднизолон, остальные 8 не принимали никаких препаратов. Все пациенты имели устойчивую болезнь, то есть никаких изменений в симптомах, рентггенографических проявлениях или исследовании функции легких за 6 недель до проведения бронхоскопии.

Пациенты с саркоидозом имели клинические особенности, совместимые с легочным саркоидозом и диагноз был поддержан биопсией легкого у 9 пациентов и положительного теста Квейма у 3 пациентов. Исслледование БАЛ было выполнено как часть клинического исследования при постановке диагноза.

Группа контроля включала одного курящего индивидуума и экскурильщика, бросившего курить 7 лет назад. Все они не имели никаких признаков легочной болезни.

Результаты

Средние уровни секреции фактора некроза опухоли альфа альвеолярными макрофагами и моноцитами

Чтобы оценить, увеличена ли секреция TNF-alpha у мононуклеарных фагоцитов у пациентов с саркоидозом, были оценены средние уровни секреции TNF-alpha альвеолярными макрофагами и моноцитами упациентов с саркоидозом по сравнению с клетками, полученными от здоровых индивидуумов.

Не имелось различий между группами пациентов по средним уровням секреции TNF-alpha альвеолярными макрофагами и моноцитами, спонтанного или после возбуждения LPS, хотя LPS возбуждение приводило к небольшому увеличению в средних уровней секреции TNF-alpha альвеолярными макрофагами и моноцитами в каждой группе исследованных пациентов.

Гетерогенность секреции фактора некроза опухоли альфа

Чтобы оценить, является ли производство TNF-alpha на участках болезни особенностью всех мононуклеарных фагоцитов, которые там накапливаются или TNF-alpha секретируется какой-либо субпопуляцией этих клеток, использовался метод RHPA, чтобы оценить число клеток, секретирующих TNF-alpha и уровней секреции отдельных клеток. Интересно, что секреция TNF-alpha альвеолярными макрофагами и моноцитами была гетерогенный и что не все альвеолярные макрофаги и моноциты секретируют TNF-alpha. Кроме того, среди секретирующих альвеолярных макрофагов и моноцитов, уровни секреции TNF-alpha значительно различались между клетками.

Процент клеток, секретирующих фактор некроза опухоли альфа

Чтобы количественно определить гетерогенность секреции TNF-alpha мононуклеарными клетками, был оценен процент альвеолярных макрофагов и моноцитов, секретирующих TNF-alpha спонтанно или после возбуждения LPS.

Наблюдалось различие между процентом альвеолярных макрофагов пациентов с саркоидозом, которые секретировали TNF-alpha и процентом альвеолярных макрофагов, которые секретировали TNF-alpha группы контроля (17 %, диапазон 10-21 % для саркоидоза; 12 %, 8-18 % для группы контроля; p < 0.05).

Средний процент клеток, секретирующих TNF-alpha, был выше для альвеолярных макрофагов и моноцитов у пациентов с саркоидозом (альвеолярные макрофаги 17 %, моноциты 9 %), но не в группе контроля (альвеолярные макрофаги 12 %, моноциты 10 %).

LPS возбуждение приводило к увеличению процента клеток, секретирующих TNF-alpha в обеих группах, с удвоением производства у моноцитов.

Полная секреция фактора некроза опухоли альфа мононуклеарными фагоцитами

Суммарная секреция TNF-alpha мононуклеарными фагоцитами зависит уровней секреции клеткой и числа альвеолярных макрофагов и моноцитов, секретирующих TNF-alpha. Чтобы оценить суммарный уровень секреции TNF-alpha этими двумя группами клеток в различных состояниях болезни, был рассчитан средний уровень секреции TNF-alpha на одну клетку и процент клеток, секретирующих TNF-alpha.

Хотя клетки пациентов с саркоидозом произвели большее количество TNF-alpha чем в группе контроля, различие не было статистически значимым. Однако, после LPS возбуждения, спонтанная секреция TNF-alpha у пациентов с саркоидозом была значительно выше, в группе контроля, в значительной степени из-за увеличения числа секретирующих TNF-alpha клеток (p=0.001).

Обсуждение

В этом исследовании было подтверждено, что TNF-alpha у пациентов с саркоидозом синтезируется почти исключительно альвеолярными макрофагами. Важно, что различие в суммарной секреции между саркоидозом и группой контроля происходит скорее из-за увеличения процента секретирующих TNF-alpha клеток, чем из-за увеличения производства отдельной клеткой. Цель исследования состояла в том, чтобы продемонстрировать различия между стадиями саркоидоза. Кроме того, уровни TNF-alpha у пациентов, получающих лечение стероидами или с историей курения, не различались от остальной группы (данные не показаны). В отличие от многих предыдущих исследований, была продемонстрирована продолжающаяся секреция TNF-alpha при стабильной болезни. При болезни, которая может иметь рецидив, кажется логичным наличие низкоуровневой секреции TNF-alpha, и это было подтверждено в нашем исследовании. Используя метод RHPA, было продемонстрировано, что при клинически бездействующей болезни может иметься персистирующее производство цитокина, что совместимо с продолжающимся воспалительным ответом.

Наши данные согласуются с другими публикациями по саркоидозу (9-15), хотя увеличенное производство TNF-alpha при устойчивой болезни контрастирует с предыдущими исследованиями, которые преимущественно включали пациентов с активной или прогрессирующей болезнью (22). Мы показали, что альвеолярные макрофаги пациентов с саркоидозом и здоровых индивидуумов секретируют большее количество TNF-alpha, чем аутогенные мноциты периферической крови, но при саркоидозе, суммарное увеличение производства TNF-alpha присходит скорее из-за увеличения процента макрофагов, секретирующих TNF-alpha, чем увеличения секреции отдельной клеткой.

В этом исследовании, клетки, ответственные за производство TNF-alpha в легком были как правило больше 13 µm², что является верхним пределом нормы. Однако, ранее опубликованные данные относительно интерлейкина-8 (15) и неопубликованные наблюдения, характеризующие клетки, секретирующие TNF-alpha у пациентов с фиброзирующим альвеолитом (P. Pantelidis), говорят, что большинство этих клеток имеет фенотип зрелых тканевых макрофагов RFD 7. Это имеет важное значение. Признано, что необходима разработка специфической терапии саркоидоза. Производство TNF-alpha на самой ранней стадии патогенеза, может быть привлекательной целью такой терапии. Одним из путей терапи является доставка специфического для определенного типа клеток лекарственного средства к местам активности болезни.