Thorax 1999;54:524-530

Взаимосвязь между TNF-alpha и растворимыми рецепторами TNF при легочном саркоидозе

Lynne Armb, Noeleen M Foley, Ann B Millar
Lung Research Group, University of Bristol Division of Medicine, Southmead Hospital, Bristol BS10 5NB, UK, Department of Respiratory Medicine, Royal United Hospital, Bath, UK

Реферат

Введение: важность фактора некроза опухоли альфа (TNF-alpha) в патогенезе легочного саркоидоза остается неясной из-за малого количества клинических особенностей, связанных с чрезмерными уровнями этого цитокина. Увеличенные уровни растворимых рецепторов TNF (TNF-R), которые, как известно, ингибируют активность TNF-alpha, недавно были описаны в легких пациентов с саркоидозом. Мы выдвинули гипотезу, что биоактивность TNF-alpha при саркоидозе может быть ингибирована присутствием TNF-R. Исследование было предпринято, чтобы впервые исследовать связь между растворимыми рецепторами и биоактивностью TNF-alpha в легких пациентов с саркоидозом. Методы: альвеолярные макрофаги (AMs) 16 пациентов с гистологически доказанным саркоидозом и 13 здоровых индивидуумов в группе контроля были культивированы в присутствии и отсутствии липополисахарида (LPS). Пациенты с саркоидозом были сгруппированы в соответствии с радиологической оценкой в стадию I (n = 6) и стадии II/III (n = 10). Супернатант культуры клеток и жидкость бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) были исследованы на биоактивность TNF с использованием WEHI. Иммунореактивность связанного и свободного TNF-alpha и свободных TNF-Rs (p55 и p75) были определены с помощью ELISA. Результаты: биоактивность TNF-alpha не была выявлена в жидкости БАЛ всех пациентов с саркоидозом и большинства в группе контроля. Однако, имелось значительно большая иммунореактивность TNF-alpha в жидкости БАЛ у пациентов с саркоидозом, чем в группе контроля (0.304 ng/ml и 0.004 ng/ml, соответственно, 95 % CI от 0.076 до 0.455, p < 0.001). Уровни p55 и p75 в ЖБАЛ были выше в группе пациентов с саркоидозом, чем в группе контроля (p < 0.0005 и p < 0.001, соответственно). В LPS-стимулируемом супернатанте, уменьшенная биоактивность TNF-alpha была замечена у пациентов со стадией I саркоидоза по сравнению с пациентами со стадией II/III болезни и группой контроля (0.333 ng/ml против 1.362 ng/ml и 2.385 ng/ml, соответственно, p < 0.01). Это контрастировало с увеличенными уровнями p55 в супернатанте, полученном у пациентов со стадией I саркоидоза по сравнению с пациентами со стадией II/III болезни и группой контроля (0.449 ng/ml против 0.058 ng/ml и 0.078 ng/ml, соответственно, p < 0.01). Уровни p75 были увеличены в нестимулированных культурах у пациентов со стадией II/III болезни по сравнению с пациентами со стадией I болезни и группой контоля (0.326 ng/ml против 0.064 ng/ml и 0.102 ng/ml, p < 0.05). Заключение: эти результаты указывают, что биоактивность TNF-alpha может быть ингибирована увеличением уровня растворимых TNF-R в легких пациентов с саркоидозом и это ингибирование может быть больше у пациентов со стадией I саркоидоза, чем со стадией II/III болезни. Это может являться гомеостатическим механизмом, который защищает легкое от чрезмерного производства TNF при хроническом воспалении.

Введение

Саркоидоз - мультисистемная болезнь, при которой до 90 % пациентов имеют раазличную степень легочного вовлечения (1). Легочный саркоидоз характеризуется накоплением T-лимфоцитов, которое предшествует развитию неказеозных эпителиоидных гранулем, которые в некоторых случаях могут вести к интерстициальному фиброзу (2). Стадия I болезни определяется как присутствие двусторонней внутригрудной лимфаденопатии (BHL) без интерстициальных изменений, принимая во внимание, что стадия II болезнь определяется как BHL с узловым затенением. Стадия III - генерализованное затенение в отсутствии BHL, в стадии IV болезни наблюдаются рентгенографические признаки фиброза. Стадия I саркоидоза обычно является самоограниченной болезнью, принимая во внимание, что стадии II - IV могут быть связаны с прогрессирующим клиническим курсом.

Фактор некроза опухоли альфа (TNF-alpha) - плейотропный провоспалительный цитокин, который вовлечен в патогенез множества воспалительных болезней легкого (3, 4). Саркоидоз является примером воспалительного ответа с увеличенным производством множества провоспалительных цитокинов (7-11), но роль TNF-alpha в патогенезе саркоидоза остается неясной. Документированное производство интерферона гамма и холекальциферола у пациентов с саркоидозом, оба из которых являются чрезвычайно эффективными индукторами TNF-alpha, предполагает их потенциальную активную роль в производстве TNF-alpha в этом состоянии (12). Несколько исследований сообщило об увеличенных уровнях TNF-alpha у пациентах с саркоидозом, (13-15).

Многие клинические и патологические особенности, связанных с TNF-alpha, например общее недомогание, потеря веса и некроз ткани, обычно не найдены у белых пациентов. Это позволило предположить, что активность TNF-alpha при саркоидозе может быть ингибирована. В 1990 г. был описан, но не охарактеризован, ингибирующий фактор в крови, но не в легких пациентов с саркоидозом (17). Впоследствие были идентифицированы две формы растворимых рецепторов TNF - p55 (CD120a) и p75 (CD120b) (18). p55 рецептор обнаружен во всех тканях человека, принимая во внимание, что экспрессия рецептора p75 ограничена клетками миелоидого происхождения (20). Оба TNF-Rs способны ингибировать биоактивность TNF-alpha in vitro (21). Хотя имеется сообщение, предполагающее, что связь TNF-alpha с его растворимыми рецепторами стабилизирует тримерную структуру TNF-alpha и поэтому может пролонгироовать его биоактивность in vivo (22), становится все более и более очевидно, что цитокины не работают изолировано, а функционируют как часть сильно регулируемой сети цитокинов, неотъемлемой частью которого являются растворимые рецепторы. Таким образом состояние, индуцирующее производство TNF-alpha, ведет к последующей индукции производства TNF-R, как части нормального регулирующего механизма обратной связи (23). Увеличенные уровни TNF-Rs были обнаружены в плазме и бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) пациентов с саркоидозом (24, 25) но связь их производства с биоактивностью TNF-alpha до настоящего времени не была исследована.

Мы исследовали связь между биоактивностью TNF-alpha и присутствием TNF-R в БАЛ и супернатанте культуры альвеолярных макрофагов в здоровой группе контроля и у пациентов с легочным саркоидозом. Пациенты были разделены на группы, на основании рентгенограмм легких в группы со стадией I болезни и стадиями II/III болезни, чтобы определить любую связь между TNF-alpha и серьезностью легочного вовлечения.

Пациенты

У пациентов с саркоидозом при постановке диагноза была проведена фибробронхоскопия с трансбронхиальной биопсией. Ни один из пациентов не получал кортикостероидную терапию. Все пациенты не курили и были симптоматическими (например, узловатая эритема, артралгия, одышка) во время проведения бронхоскопической экспертизы. Диагноз саркоидоз был подтвержден присутствием гранулем в материале трансбронхиальной биопсии у всех пациентов. 13 здоровых некурящих индивидуумов дали согласие на проведение фибробронхоскопии с бронхоальвеолярным лаважем. Проведение исследования было одобрено комитетом по этике Southmead NHS.

Результаты

Биоактивность TNF-alpha и TNF-R в БАЛ

Все образцы ЖБАЛ в обеих группах пациентов (стадия I и стадия II/III) имели уровни биоактивного TNF-alpha выше 0.003 ng/ml - предела чувствительности для этого теста. Среднее значение для группы контроля было 0.004 ng/ml. Уровни p55 были значительно увеличены в БАЛ пациентов со стадией I болезнь по сравнению с группой контроля (2.10 ng/ml против 0.23 ng/ml, 95 % CI от 0.79 до 12.31, p = 0.001) и пациентов со стадией II/III болезни по сравнению с группой контроля (4.36, 95 % CI от 0.81 до 5.25, p = 0.0002). Не имелось никаких существенных различий между двумя группами пациентов с саркоидозом. Уровни p75 были 0.331 ng/ml, 4.629 ng/ml и 4.371 ng/ml для группы контроля и пациентов со стадией I и стадиями II/III болезни, соответственно. Существенных различий между двумя группами пациентов с саркоидозом обнаружено не было, но БАЛ пациентов со стадией I, болезни (95 % CI от 0.648 до 10.416, p = 0.0006) и стадиями II/III болезни (95 % CI от 1.081 до 5.586, p = 0.005) содержал большее количество p75, чем БАЛ группы контроля.

Биоактивность TNF-alpha в супернатанте

Производство TNF-alpha AMs был уменьшено у пациентов со стадией I саркоидоза по сравнению с другими группами, 0.532 ng/ml, 0.173 ng/ml и 0.468 ng/ml для группы контроля, пациентов со стадией I саркоидоза и стадией II/III болезни, соответственно. Однако, индуцированное LPS производство TNF-alpha в группе контроля было 2.385 ng/ml по сравнению с 0.333 ng/ml в группе со стадией I болезни (95 % CI от 0.498 до 2.693, p = 0.004) и 1.362 ng/ml в группе со стадией II/III болезни. Различия в LPS-индуцированном производстве TNF-alpha между двумя группами пациентов с саркоидозом существенно различалось (95 % CI от 0.327 до 6.298, p = 0.008). Четыре самых высоких уровня LPS-индуцированного производства TNF-alpha наблюдались в культурах, полученных от пациентов со стадией II саркоидоза.

P55 TNF-R в супернатанте

Производство P55 AMs у пациентов со стадией I саркоидоза было увеличено по сравнению с другими группами. В нестимулируемых культурах группы контроля, средний уровень p55 был 0.088 ng/ml по сравнению с 0.476 ng/ml в группе со стадией I саркоидоза (95 % CI от 0.161 до 0.762, p = 0.0008) и 0.033 ng/ml в группе со стадией II/III болезни. Производство P55 нестимулированными AMs было значильно выше в группе со стадией I, чем со стадией II/III (95 % CI от 0.132 до 0.756, p = 0.008). Подобные различия также наблюдались в LPS-стимулируемых культурах между группой контроля и пациентами со стадией I болезни (0.078 ng/ml и 0.449 ng/ml, соответственно, 95 % CI от 0.081 до 0.07, p = 0.003) и между пациентами со стадией I и стадией II/III болезни (стадия II/III 0.058 ng/ml, 95 % CI от 0.069 до 0.530, p = 0.01).

P75 TNF-R в супернатанте

В нестимулируемых культурах пациентов со стадией II/III болезни наблюдалось большее количество p75 чем у пациентов со стадией I болезни и группы контроля (0.326 ng/ml против 0.064 ng/ml (95 % CI от 0.028 до 0.395, p = 0.02) и 0.102 ng/ml (95 % CI от 0.157 до 0.362, p = 0.002) соответственно). Когда AMs стимулировались LPS, средние уровни были 0.448 ng/ml, 0.424 ng/ml и 0.169 ng/ml, соответственно, для пациентов со стадией II/III болезни, стадией I болезни и группы контроля. Различие между группой контроля и пациентами со стадией II/III болезни осталось статистически значимым (95 % CI от 0.02 до 0.437, p = 0.03).

Сравнение иммунореактивности и биоактивности TNF-alpha в БАЛ и супернатанте

Сравнение иммунореактивности и биоактивности TNF-alpha было сделано при исследовании ЖБАЛ. Супернатант был получен у 5 здоровых индивидуумов в группе контроле и 6 пациентов с саркоидозом (2 со стадией I и 4 со стадией II/III). Иммунореактивность TNF-alpha была увеличена по сравнению с биоактивностью TNF-alpha в большинстве образцов обеих групп, но увеличение было самым большим у пациентов с саркоидозом. Также наблюдалась большая иммунореактивность по сравнению с биоактивностью TNF-alpha в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом. Также был значительно увеличен полный уровень TNF-alpha в ЖБАЛ пациентов с саркоидозом по сравнению с группой контроля (0.304 ng/ml и 0.004 ng/ml, соответственно, 95 % CI от 0.076 до 0.455, p = 0.001). Два образца с самыми высокими уровнями TNF-alpha в стимулированой и нестимулированной LPS культуре, были получены у пациентов со стадией I саркоидоза.

Обсуждение

Это первое исследование, которое сравнило биоактивность TNF-alpha, присутствие растворимых рецепторов TNF у пациентов со стадией I и стадией II/III саркоидоза с группой контроля. Мы не обнаружили значительного увеличения биоактивности TNF-alpha в БАЛ или в супернатанте у пациентов со стадией I или стадией II/III саркоидоза по сравнению с группой контроля, хотя самый высокие уровни биоактивного TNF-alpha были обнаружены у пациентов со стадией II/III болезни. Пациенты со стадией I фактически имели значительно уменьшенную биоактивность TNF-alpha по сравнению с другими группами.

Роль TNF-alpha в патогенезе саркоидоза остается спорной (12-16), хотя большинство исследований отмечает увеличенное производство TNF-alpha. Большинство предыдущих исследований, для определения уровней TNF-alpha использовали радиоиммуноанализ или ELISA, которые позволяют различать связанные и несвязанные цитокины. Используя R & D ELISA для определение полных уровней TNF-alpha вместе с WEHI для определения биологической активности, мы показали, что в легких пациентов с саркоидозом, большинство TNF-alpha находится в биологически бездействующей форме. В исследовании Bachwich (16) было использоваго альтернативное определение биологической активности (использование линии клеток L929), но они также не нашли увеличения биоактивности TNF-alpha в ЖБАЛ или супернатанте, за исключением AMs пациентов с активным саркоидозом, стимулируемых 10 µg/ml LPS, где наблюдалось небольшое увеличение. Мы наблюдали подобный ответ у наших пациентов со стадией II/III болезни. Факт, что результаты нашего исследования и данные Bachwich (16) являются в значительной степени сопоставимыми, выдвигает на первый план важность определения биологической активности всякий раз, рассматривается возможность участия цитокина в патогенезе болезни.

В этом исследовании мы обнаружили различие между стадией I болезни, которая часто имеет самоограниченный клинический курс и не требует лечения, и стадиями II и III болезни, где может происходить прогресс вовлечения легкого и ухудшение функции легкого. Наши результаты говорят, что биоактивность TNF-alpha у пациентов со стадией I болезни ограничена, и это может быть важным фактором, который предотвращает развитие интерстициальных изменений, несмотря на присутствие мононуклеарного альвеолита и гранулем.

Вероятное объяснение уменьшенной биоактивности TNF-alpha в стадии I болезни - ингибирующее действие растворимых TNF-R, особенно p55. Мы обнаружили значительно увеличенные уровни p55 и p75 TNF-R в ЖБАЛ у пациентов со стадией I и стадиями II/III болезни по сравнению со здоровой группой контроля и увеличенное производство p55 и p75 TNF-R в стадии I и стадии II/III AMs, соответственно, in vitro. Присутствие увеличенных уровней TNF-R в биологических жидкостях нельзя объяснить ослаблением связывания или уменьшением свободного TNF-alpha, так как у пациентов с саркоидозом с помощью R & D ELISA были обнаружены как свободные, так и связанные формы TNF-alpha в ЖБАЛ. Способность растворимых TNF-R нейтрализовать биологическое действие TNF-alpha, была выдвинута на первый план в исследованиях in vivo. Инфузия P55 TNF-R производит резистентность к летальным эффектам TNF-alpha (28). p55 TNF-R трансгенные мыши демонстрируют резистентность к инфузии LPS (29). Наши данные и данные исследования (30) говорят, что у пациентов со стадией I болезни может иметься нарушение баланса TNF/TNF-R в пользу TNF-R. Это также поддерживается исследованием (25), которое обнаружило значительно увеличенные уровни p75 в ЖБАЛ и существенную корреляцию между уровнями p75 и числом лимфоцитов у пациентов с саркоидозом. Аутокринный регулирующий механизм, который мы предлагаем для AMs, подобен механизму для моноцитов нормальной крови (31). Было показано, что AMs в легких пациентов с саркоидоз имеют фенотип, который походит на фенотип моноцитов периферической крови. Это говорит, что они могут быть привлечены из кровообращения (32).

Известно, что TNF-Rs являются ингибиторами биоактивности TNF-alpha in vivo (28, 33) и что они являются частью регулирующего ответа при острых заболеваниях, таких как менингит (34), сепсис (35, 36) а также при ответе на стимуляцию LPS в экспериментах (37). Однако, увеличенные уровни TNF-R коррелировали со смертностью в исследовании пациентах с сепсисом (37). Инфузия TNF-R приводила к увеличению времени жизни TNF-alpha в животных моделях эндотоксинемии, что говорит, что присутствие TNF-R скорее может быть связано с увеличенным поврежденим, чем с защитой (31). Это подразумевает, что ограничение биоактивности TNF-alpha при остром воспалительном ответе может вести к замедлению разрешения и возможно к развитию хронического состояния. Так как этиология саркоидоза неизвестна, эта теория не может быть применима непосредственно, но демонстрирует, что так называемые ''выгодные'' медиаторы могут быть вредны при некоторых обстоятельствах.

Биоактивность TNF-alpha уменьшена у пациентов со стадией I саркоидоза по сравнению с пациентами со стадией II/III болезни и здоровой группой контроля. Эта уменьшенная биоактивность может быть следствием увеличенного производства TNF-R. Хотя AMs ЖБАЛ не обязательно непосредственно отражают воспалительные процессы, происходящие в пределах саркоидной гранулемы, это сообщение указывет на существоваение важного гомеостатического механизма, который может предотвращать развитие интерстициальной болезни легкого, более характерной для стадии II/III саркоидоза.