УДК 616.24-002.182-008.9-07
КЛЕТОЧНЫЙ И ФОСФОЛИПИДНЫЙ СОСТАВ БРОНХОАЛЬВЕОЛЯРНЫХ СМЫВОВ БОЛЬНЫХ САРКОИДОЗОМ

И.Л. КОТОВИЧ
Минский медицинский институт, Минск, Беларусь

Мы исследовали бронхоальвеолярные смывы (БАС) 20 больных саркоидозом (саркоидоз 1 тип, n=11; саркоидоз 2 тип, n=9) и 8 здоровых добровольцев (контрольная группа). Липиды экстрагировали из концентрированного БАС и разделяли. Количественный учет фосфолипидных фракций вели по содержанию липидного фосфора. Оценивалась также цитограмма БАС и концентрация общего белка. При саркоидозе органов дыхания отмечены существенные нарушения со стороны сурфактантной системы легких. Обнаружено
статистически достоверное уменьшение содержания общего липидного фосфора и основных фракций сурфактанта в БАС больных саркоидозом (1 и 2 тип) по сравнению с контролем; значительное увеличение концентрации белка в БАС; имелась тенденция к увеличению числа лимфоцитов при саркоидозе.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: системная красная волчанка, бронхоальвеолярные смывы, антитела к кардиолипину.

Саркоидоз относится к системным гранулематозам и характеризуется преимущественным поражением легких и внутригрудных лимфатических узлов. Происхождение данного заболевания до настоящего времени остается неизвестным. Диагностика саркоидоза затруднена, поскольку зачастую отсутствуют какие-либо клинические признаки поражения легких, а рентгенологическая картина сходна со многими другими заболеваниями (например, с туберкулезом, лимфогранулематозом, экзогенным аллергическим альвеолитом, идиопатическим фиброзирующим альвеолитом и др.) [1]. Точный диагноз помогает поставить обнаружение в биоптатах пораженных тканей специфических эпителиоидных гранулем без казеоза. Однако, к сожалению, реальная клиническая эффективность метода биопсии составляет лишь 40-50%.

Для разработки других достоверных диагностических и дифференциально-диагностических критериев саркоидоза необходимо тщательное изучение характера изменений, наблюдающихся в легких при данной патологии.

В настоящее время большую помощь в диагностике саркоидоза оказывает исследование бронхоальвеолярных смывов (БАС). Установлено, что характерным признаком для данного заболевания является изменение клеточного состава БАС со значительным увеличением содержания лимфоцитов (40-60% и более, тогда как у здоровых людей лимфоциты редко превышают 12%). Лимфоциты представлены главным образом Т-клетками, а именно Т-хелперами.

Наличие таких изменений в эндопульмональной цитограмме у лиц с саркоидозом позволяет говорить о том, что в ходе заболевания у больных развивается Т-клеточный альвеолит [14,15].
При попытке объяснить патогенетические механизмы возникновения и поддержания воспалительного процесса в альвеолах при саркоидозе нельзя не вспомнить о сурфактантной системе легких. Сурфактант играет жизненно важную роль в функционировании легких. Он уменьшает силы поверхностного натяжения на границе раздела фаз воздух-жидкость в альвеолах, способствует поддержанию альвеолярного гомеостаза, обладает целым рядом иммуномодулирующих свойств. Основу сурфактанта составляют фосфолипиды (ФЛ) - именно они обусловливают поверхностно-активные свойства сурфактанта, обеспечивают стабилизацию альвеол в процессе дыхания, а также участвуют в регуляции иммунного ответа. Так, в частности, известна способность ФЛ сурфактанта подавлять иммунные реакции, опосредованные лимфоцитами и макрофагами. При этом подавляется пролиферация клеток, уменьшается выработка иммуноглобулинов, снижается цитотоксичность [7,9,15].

Бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ) является весьма доступным методом выделения от больного компонентов сурфактанта легких, поскольку в БАС содержатся все элементы, находящиеся в выстилке эпителиальной поверхности терминальных отделов дыхательных путей. Между тем, литературные данные о характере изменений ФЛ сурфактанта легких при саркоидозе немногочисленны, а полученные результаты противоречат друг другу. [4,8,10,11,14]. Задачей нашего исследования стало изучение клеточного состава, общего белка и ФЛ в БАС при саркоидозе органов дыхания и определение значимости тех или иных изменений для диагностики данного заболевания.

Материалы и методы исследования.

Мы исследовали БАС 20 больных саркоидозом в возрасте от 18 до 49 лет. Из них у 11 (6 курящих и 5 некурящих) наблюдался I рентгенологический тип заболевания, а у 9 (2 курящих и 7 некурящих) - II тип. Диагностика основывалась на данных клинического, рентгенологического, морфологического, бактериологического методов исследования. Контрольная группа состояла из 8 добровольцев (3 курящих и 5 некурящих), не имеющих жалоб и клинических признаков острых или хронических легочных заболеваний.
БАС были взяты у всех исследуемых в ходе фибробронхоскопии по методике, разработанной ЦНИИТ МЗ СССР [10]. Для лаважа использовали 200 мл стерильного физиологического раствора. Полученную лаважную жидкость фильтровали через 4 слоя марли для удаления слизи. Часть полученного БАС (около 20 мл) использовали для цитологического и иммунологического исследований. Общее количество клеток подсчитывали в свежеполученном лаваже (без центрифугирования) в камере Фукса-Розенталя.

Жизнеспособность альвеолярных макрофагов определяли по способности клеток воспринимать окраску трипановым синим. Оставшийся БАС центрифугировали с целью осаждения клеток. Осадок использовали для приготовления мазков и подсчета клеточной формулы БАС. Супернатант концентрировали и проводили определение фосфолипидов (ФЛ).

Липиды экстрагировали по Folch и соавт. [6]. Фракционирование ФЛ осуществляли методом тонкослойной хроматографии. Разделение проводили в системе растворителей хлороформ:метанол:вода (65:25:4 по объему) и получали фракции лизофосфатидилхолина (ЛФХ), сфингомиелина (СМ), фосфатидилхолина (ФХ), суммарную фракцию фосфатидилэтаноламина (ФЭА). Для определения динасыщенного ФХ (ДНФХ) применяли двумерную тонкослойную хроматографию [12]. Количественный учет фосфолипидов вели по содержанию липидного фосфора. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически методом Lowry.

Результаты и их обсуждение
Общее количество клеток в БАС больных существенно не отличалось от здоровых (см. табл. 1). У курящих во всех группах исследуемых общее число клеток значительно превышало таковое у некурящих. Жизнеспособность альвеолярных макрофагов составляла 70-95%. Достоверных различий в клеточной формуле БАС больных саркоидозом и здоровых не выявлено, хотя отмечалась тенденция к увеличению числа лимфоцитов при саркоидозе.

Таблица 1 Клеточный состав БАС у больных саркоидозом

Результаты определения содержания ФЛ (в микромолях липидного фосфора на литр БАС) и белка (в граммах на литр БАС) представлены в табл.2.

Таблица 2 Уровень общего белка и фосфолипидов БАС у больных саркоидозом органов дыхания

* - p<0,05 по сравнению с контролем

Преобладающая фракция ФЛ во всех исследуемых группах была представлена ФХ (более 70% которого составлял ДНФХ, что свидетельствует о принадлежности выделенных ФЛ к сурфактанту легких) [4,5]. У больных саркоидозом в БАС наблюдалось статистически достоверное уменьшение содержания общего липидного фосфора. Содержание основных фракций ФЛ (ФХ, ДНФХ, ФЭА) также было значительно меньше, чем в контрольной группе. Достоверных различий между двумя формами саркоидоза не отмечалось. У курящих не наблюдалось существенных отклонений в содержании ФЛ по сравнению с некурящими в пределах одной исследуемой группы.

Процентный состав отдельных фракций ФЛ по отношению к общим фосфолипидам в контрольной группе был следующим: ЛФХ – 2,1±0,5%; СМ - 3,9±1,1%; ФХ сумм – 71,6±2,1%; ФЭА - 19,3±1,4%. При саркоидозе относительное содержание СМ значительно увеличивалось (9,5±0,8%). Концентрация общего белка в БАС больных, была существенно выше, чем в контрольной группе.

Результаты проведенных исследований показали, что у больных саркоидозом органов дыхания наблюдаются существенные нарушения со стороны сурфактантной системы легких. Уменьшение содержания общих фосфолипидов, а также основных сурфактантных фракций (а именно ФХ и ДНФХ) свидетельствует о наличии значительных функциональных изменений на уровне альвеолярного пространства.

Уменьшение содержания ФЛ сурфактанта в БАС больных саркоидозом легких может быть связано с
повреждением альвеолоцитов II типа (А- II) - клеток, ответственных за синтез и секрецию основных компонентов сурфактанта. Наличие воспалительного процесса и связанных с ним структурных изменений в стенке альвеол (отек и набухание основного вещества соединительной ткани, утолщение аэрогематического барьера, нарушения микроциркуляции, клеточная пролиферация) приводят к гипоксии А- II и снижению их функциональной активности [6,16]. Уменьшение содержания в альвеолярной выстилке ФЛ при саркоидозе может способствовать развитию у таких больных иммунологических реакций.

Известно подавляющее действие ФЛ сурфактанта на иммунный ответ. При уменьшении содержания ФЛ ослабляется их ингибирующий эффект на такие процессы, как пролиферация клеток, выработка иммуноглобулинов, цитокинов. Все это способствует развитию клеточных реакций в альвеолах (в частности, активированию и пролиферации Т-лимфоцитов) и появлению характерной для саркоидоза картины в цитограмме БАС.

Выводы
1. Достоверных различий в клеточном составе БАС больных саркоидозом и здоровых не отмечается, хотя имеется тенденция к увеличению числа лимфоцитов при саркоидозе.
2. При саркоидозе органов дыхания концентрация белка в БАС значительно увеличивается по сравнению с контролем, а также наблюдаются изменения со стороны сурфактантной системы легких, что выражается в уменьшении содержания общих фосфолипидов и основных сурфактантных фракций (ФХ, ДНФХ, ФЭА) в БАС.

ЛИТЕРАТУРА
1. Диагностика и лечение саркоидоза органов дыхания (методич. рекомендации) (сост. Хоменко А.Г.,
Озерова Л.В., Филиппов В.П. и др.). //Проблемы туберкулеза.-1993-№6-с.47-51.
2. Диагностический бронхоальвеолярный лаваж. Методич. рекомендации (сост. Филипов В.П., Лебедев К.М., Крюков В.Л. и др.).// Проблемы туберкулеза.-1988-№3-с.65-67.
3. Ерохин В.В. Функциональная морфология легких. М.:- Медицина, 1987-272 с.
4. Скрягина Е.М. Фосфолипидный состав сурфактанта и альвеолярных макрофагов бронхоальвеолярного смыва в диагностике и оценке эффективности лечения у больных туберкулезом легких.// Автореф. дисс. ... канд.мед.наук- Мн.- 1994, 17 с.
5. Скрягина Е.М., Абрамовская А.К., Гуревич Г.Л. Дифференциально-диагностическое значение определения содержания фосфолипидов сурфактанта при заболеваниях легких. //Проблемы туберкулеза- 1998- №4- с.51-53.
6. Folch IL, Lees M, Sloane-Stanley GH. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. // J. Biol. Chem.- 1957- v.226- №1- p.497-509.
7. Griese M. Pulmonary surfactant in health and human lung diseases: state of the art. //Eur. Resp. J.- 1992- v.13- p.1455-1476.
8. Gunther A., Schmidt R., Nix F. et al. Alterations of biochemical and biophysical surfactant properties in interstitial lung diseases. //Applied cardiopulm. Pathophysiology.- 1995-v.5- suppl.3- p.46.
9. Haslam PL, Postle AD, Raimondos K. Measurement of pulmonary surfactant components and function in bronchoalveolar lavage fluid. //Eur. Resp. J.- 1999- v.9- №66- p.43-69.
10. Honda Y., Tsunematsu K., Suzuki A et al. Changes in phospholipids in bronchoalveolar lavage fluid of patients with interstitial lung diseases. //Lung.- 1988- v.166-№5- p.293-301.
11. Low RB, Davis GS, Bell DY et al. Lipids in bronchoalveolar lavage fluid from patients with sarcoidosis. //Thorax.- 1987- v.42- p. 926-932.
12. Mason RJ, Nellenbogen J, Clements JA. Isolation of disaturated phosphayidylcholine with osmium tetroxide. //J Lip. Research.- 1976- v.17- p.281-284.
13. Robinson PC, Watters LC, King TE. Idiopathic pulmonary fibrosis. Abnormalities in bronchoalveolar lavage fluid phospholipids. //Am.Rev.Resp. Dis.- 1988- v.137-№3- p.585-591.
14. van de Graaf EA, Jansen HM, Lutter R et al. Surfactant protein A in bronchoalveolar lavage fluid. // J.Lab.Clin. Med.- 1992- v.120- №2- p.252-63.
15. Wilsher ML, Huges DA, Haslam PL. Immunoregulatory properties of pulmonary surfactant: effect of lung lining fluid on proliferation of human blood lymphocytes. //Thorax.- 1988- v.43- №5- p. 354-359.
16. Zetterberg G, Curstedt T, Eklund A. A possible alteration of surfactant in bronchoalveolar lavage fluid from healthy smokers compared to non-smokers and patients with sarcoidosis. //Sarcoidosis.- 1995- v.12- №1- p. 46-50.